一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因的RNA标准对照（NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA）,线性范围分别为4.6×101-4.6×107和4.1×101-4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）发生交叉反应。用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性。本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立二重荧光定量RT-PCR方法,用于禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的检测。方法:根据AIV和NDV的基因保守序列,设计了AIV和NDV的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR方法。结果:所建方法特异性好,对AIV和NDV的检测敏感性均达到2000个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,对AIV和NDV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测2种病毒。对保存的AIV或NDV鸡胚尿囊液及临床病料进行二重荧光定量RT-PCR检测,结果尿囊液检测的拷贝数均达到1010/μL以上,临床病料的拷贝数为2.13×108～6.52×104/μL。结论:建立了用于检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对AIV和NDV的防制有重要意义。

通用型和O型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立通用型和O型口蹄疫病毒(FMDV)二重荧光定量RT-PCR检测方法,本试验根据GenBank已登录的不同亚型FMDV通用序列和O型FMDV序列设计了2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针,经过反应条件和体系优化,建立了通用型(T型)和O型FMDV的二重荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;对15份临床疑似样品进行了应用检测。结果表明,成功建立通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,该方法可特异性地扩增经灭活的O型、A型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒标准株细胞培养物混合物,但对BHK-21细胞和PEDV、TGEV、SVV等病原对照不出现特异性扩增曲线,特异性好;检测模板最低极限为1.0×101拷贝/μL,敏感性高,重复性好;自15份临床疑似FMDV感染样品中检出9份FMDV-T阳性,7份FMDV-O阳性,检测结果与测序结果完全一致,且与国家口蹄疫参考实验室复核结果一致。本试验成功建立了通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,为FMDV的快速检测及O型FMDV的分型诊断提供了特异、敏感、快速的方法。

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S基因序列和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因序列,设计特异性的引物和探针。通过对引物和探针浓度等反应液用量以及反应条件等因素进行优化试验,建立了能同时鉴别检测TGEV和PEDV的二重荧光RT-PCR方法。用该方法同时检测其他病原如Po RV、PCV和CSFV时不发生交叉反应,特异性好;较普通PCR均高出3个数量级的敏感性,能够检测10 TGEV和10 PEDV拷贝数,敏感性高;组内重复和组间重复试验结果变异系数小,稳定性好;同时检测2个模板的不同浓度组合试验,干扰性小。本试验建立的二重荧光RT-PCR方法可用于TGEV和PEDV的鉴别检测,且具有特异、敏感、稳定、快速等优点,为进一步应用于TGEV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

本试验旨在建立同时检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和鸭瘟病毒(DPV)的二重荧光定量RT-PCR方法。针对GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系、条件及评价其特异性、敏感性,建立了检测DTMUV和DPV的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法对DTMUV和DPV的检测灵敏度均达100个模板拷贝数,同时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。本研究建立的DTMUV和DPV二重荧光定量RT-PCR具有敏感、快速、特异、定量、重复性好等优点,可用于DTMUV和DPV感染的快速鉴别诊断。

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR方法的建立

为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。

H4亚型和N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简单、快速鉴别H4亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的保守区域,分别设计筛选出1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型和N2亚型AIV二重RT-PCR检测方法。该法可特异性扩增H4亚型和N2亚型AIV,对其他亚型AIV和常见禽病病原体无交叉反应;对H4亚型和N2亚型AIV的检测下限均为104拷贝/μL;对152份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的二重RT-PCR方法为H4亚型和N2亚型AIV的诊断提供了快速、特异、敏感和有效的检测方法。

小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立

对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVⅣ系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明:建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道(通用型)和TAMRA信号通道(Ⅱ系疫苗毒特异型)的检测灵敏度分别可达101TCID50/mL和102TCID50/mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。

一种鉴别非洲猪瘟病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异的鉴别检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的方法,以ASFV CP530R基因和HP-PRRSV NSP2基因为靶序列分别设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,该方法对ASFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪流感病毒发生交叉反应。该方法对含有ASFV CP530R靶序列的质粒标准对照（pCR2.1-ASFV-CP530R）定量检测的线性范围为6.1×101~6.1×108 copies/μL,对含有HP-PRRSV NSP2基因靶序列的RNA标准对照（HPPRRSV-NSP2-RNA）的定量线性范围为4.1×101~4.1×108 copies/μL,最低检出限分别为61copies/μL和41copies/μL。对3个浓度的pCR2.1-ASFV-CP530R和PRRSV-NSP2-RNA进行组内和组间重复性试验,Ct值的变异系数均小于1.60%,表明该方法具有良好的重现性。用该方法对276份实际样品进行ASFV和HP-PRRSV同时检测,全部样本的ASFV检测结果为阴性,有8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性,其余样本HP-PRRSV检测结果为阴性。上述结果表明,本研究建立的方法可为实际样本中ASFV和HP-PRRSV的同时鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒TaqMan二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛轮状病毒(BRV)VP6基因序列,设计特异性引物和探针。通过对引物和探针浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和Taq酶用量以及反应条件等因素的优化筛选,建立了能同时鉴别BVDV和BRV的二重荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,与其他病原如CSFV、MB和IBRV不发生交叉反应;敏感性高,能够检测100个BVDV RNA和100个BRV RNA;稳定性好,批内重复和批间重复变异系数小;干扰性试验表明该方法能同时检测2个模板的不同浓度组合。本研究建立的二重荧光RT-PCR方法可用于BVDV和BRV检测,具有特异、敏感、快速、稳定等优点,是BVDV和BRV基础研究、流行病学调查和临床检测的良好工具。

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RTPCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在101~107拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。

转基因玉米NK603基体标准物质研制

转基因安全管理和标识制度的实施需要标准化的检测方法和转基因检测标准物质,转基因标准物质是获得准确、可靠、可比检测结果的保证。目前,转基因玉米NK603已在我国批准进口用作加工原料,其安全监管亟须制备标准物质。本研究将筛选后的转基因玉米NK603杂合种子和对应的非转基因受体种子,按转基因质量分数为60.0 mg g^(–1)、100.0 mg g^(–1)、1000 mg g^(–1)(理论值)的比例配置了3个梯度浓度水平的转基因基体标准物质。利用二重微滴数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)对研制的标准物质进行均匀性与稳定性检测。结果表明:研制的标准物质均匀性良好,可在60℃下运输14 d,稳定性不低于6个月。同时,由8家实验室采用二重ddPCR方法联合测定标准物质NK603转化体与内标基因的拷贝数比值,其标准值及不确定度为:(2.75±0.26)%、(4.68±0.39)%、(51.8±3.7)%。本批标物使用时最小取样量100 mg。可用于转基因食品和饲料中转基因成分NK603的定性和定量检测以及转基因玉米特异性检测方法的评价和实验室质量控制等领域。