大蕉枯萎病菌二重PCR分子快速检测技术的建立

【目的】基于大蕉枯萎病菌2个不同分化谱系特有的基因序列,建立大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测技术,为该病害预测及有效防控提供理论依据。【方法】基于大蕉枯萎病菌特有的rDNA基因间隔区(IGS)序列设计得到多对PCR引物,分别以广东3个粉蕉枯萎病菌株和8个大蕉枯萎病菌株、2个广西和海南的粉蕉枯萎病菌株、5个其他尖孢镰孢菌菌株和5个外围菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,基于扩增结果从中筛选出大蕉枯萎病菌特异性引物,对其特异性和灵敏度进行检测,并确定二重PCR检测体系的含菌量检测下限。【结果】基于大蕉枯萎病菌特有的基因序列设计得到多对PCR引物,经筛选验证获得2对可用于检测大蕉枯萎病菌2个不同谱系(LineageⅠ和Ⅱ)的特异性引物,可直接应用于大蕉种植土壤和植株中的大蕉枯萎病菌检测,扩增片段分别为755和590 bp。当扩增条带为755 bp时,表明样本中含有大蕉枯萎病菌;当扩增条带为590 bp时,表明样本中含有粉蕉或大蕉枯萎病菌。建立的二重PCR检测体系检测大蕉枯萎病菌菌丝的灵敏度可达0.4μg,检测土壤的含菌量下限为每克土壤40个病原菌孢子。【结论】建立的二重PCR检测技术实现一次PCR反应同时检测并区分大蕉枯萎病菌2个谱系及广东地区的粉蕉枯萎病菌优势菌群,可用于无病大蕉和粉蕉种苗及种植土壤的检测与筛选。

二重PCR检测猪、鸡源致病性大肠杆菌、沙门氏菌磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)的研究

利用二重PCR对临床分离的猪、鸡源致病性大肠杆菌103株和沙门氏菌33株的3个磺胺类药主要耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了检测。结果表明,在19株耐SD的沙门氏菌中有17株检测出Sul1或Sul2基因,检出率为89.47%,与药敏试验的结果相比,符合率为89.47%;在56株耐SD的大肠杆菌中有53株检出耐药基因,与药敏试验的符合率为94.64%。二重PCR方法与常规PCR的结果符合率为98.5%,具有很高的一致性;与药敏试验也有很好的符合率,具有较高的特异性。整个试验过程只需7 h,比常规PCR节约7 h,检测速度有了较大的提高。

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR鉴别检测方法的建立

针对羊痘病毒(capripoxvirus,CaPV)的A29L基因和羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的H3L基因,设计、合成了2对特异性引物以进行二重PCR。结果表明,该方法可以在数小时、在同一反应体系中清晰地区分CaPV和ORFV,其PCR产物大小分别为413 bp和708 bp,与预期的片段大小相符,序列分析证实目的基因序列与已发表的序列一致;该检测方法的灵敏度可达1个病毒蚀斑形成单位(PFU)。采用二重PCR对12株CaPV、ORFV和相关病毒、细菌培养物,以及22份田间样品进行检测,与预期结果完全一致,且与相关病毒或健康羊组织样品无交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可作为临床样品中CaPV和ORFV的鉴定和诊断的有效方法。

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。

EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。

水产品中副溶血性弧菌特异性二重PCR检测方法的研究

建立快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)的二重PCR方法。以副溶血性弧菌特异性基因tlh和toxR为靶基因,选择2对引物,对5株副溶血性弧菌和40株非副溶血性弧菌进行特异性检测;梯度稀释副溶血性弧菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增;在鱼肉样品中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增;应用该方法对实际样品进行检测。以tlh和toxR为靶基因的两对引物对副溶血性弧菌的检出有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到28.76pg;人工污染样品,当起始污染量为1CFU/mL时,37℃增菌培养10h即可检出。本试验一共检测了21份水产品样品,有14份检出了副溶血性弧菌。

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法。该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

动物性食品源空肠弯曲杆菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，cj）的16SrDNA及hip O（编码马尿酸酶基因）序列设计两对特异引物，建立检测动物性食品源cj的二重PCR方法，并应用于样品检测。结果显示只对Cj能特异的扩增出699bp和366bp两个基因片段，而大肠杆菌、沙门氏菌等其他11种细菌均未扩增出条带；Cj标准株ATCC33560的16SrDNA及hip O序列与GenBank其他Cj的相应序列具高度相似性（分别为99．7％～99．9％，98．1％～99．7％）；该方法可在27h内完成，其灵敏度为2．4～16CFU／mL；四川省雅安市鸡肉、猪肉、牛肉和牛奶样品中的Ci阳性率分别为38．0％（19／50）、28．3％（15／53）、17．1％（6／35）和8．6％（4／46）。

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRVgE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRVgD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRVgD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%。说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义。

鸡传染性贫血病毒与禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法的建立

当前养鸡业中鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒混合感染的发生率日益增高,为提高CIAV、REV检测效率,根据GenBank上登录的CIAV全基因序列和REV的LTR序列分别设计了2对引物,建立了REV、CIAV二重PCR检测方法,另外还比较了2种不同的DNA提取方法。结果显示,该方法扩增目的条带清晰、敏感性高、特异性好。应用建立的方法对临床7份病料样品检测,检出5份CIAV、REV阳性,表明建立的二重PCR方法能有效用于CIAV、REV混合感染的临床诊断。

二重PCR快速检测牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的研究

根据伊氏锥虫ITS序列(FJ416612)和GenBank报道的牛巴贝斯虫棒状结合蛋白1序列(FJ588013),设计合成2对特异性诊断引物,建立了牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的二重PCR诊断方法。结果表明,建立的二重PCR诊断方法可扩增出牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的特异性条带,大小分别为213bp和360bp,最低检出量分别为4.00pg和0.38pg。但对牛双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、环形泰勒虫、附红细胞体、巴氏杆菌不敏感。用该二重PCR方法对95份水牛样品和134份奶牛样品进行检测,结果发现,水牛伊氏锥虫的感染率为13.7%(13/95)、牛巴贝斯虫的感染率为7.4%(7/95),无混合感染;奶牛伊氏锥虫的感染率为3.7%(5/134)、牛巴贝斯虫的感染率为0(0/134)。说明该二重PCR方法具有敏感、快速、特异的特点,适用于牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的流行病学调查。

黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

"裂头病"是黄颡鱼养殖业的主要病害之一,其病原为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌。以GenBank所收录鮰爱德华氏菌与迟钝爱德华氏菌16S rRNA基因为模板,优化设计两对特异性引物,经多重PCR反应体系优化及特异性与敏感性检测,建立了检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的二重PCR检测方法。结果显示,阳性对照样品的琼脂糖凝胶电泳条带同时检测到鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌,扩增产物大小分别为470 bp及268 bp,灵敏度为1.38 ng/μL。此法用于检测江西南昌地区多个养殖场所患"裂头病"黄颡鱼脑部DNA,11份患病黄颡鱼的脑部组织均检出鮰爱德华氏菌,表明该地区黄颡鱼所患"裂头病"的病原菌为鮰爱德华氏菌,此结果与常规细菌分离鉴定的检测结果一致。所建二重PCR检测法敏感度高,特异性强,检测成本低,对黄颡鱼"裂头病"的快速诊断与流行病学调查有较好的应用价值。

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。

猪细小病毒和猪源脑心肌炎病毒的二重PCR检测方法的建立

试验旨在建立能同时检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪源脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EM-CV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中PPV VP2基因和EMCV 3D基因序列,利用Premier 5.0软件设计出PPV和EMCV的特异性引物。通过优化反应条件,建立了能同时特异性检测PPV和EMCV的二重PCR方法,PPV和EMCV的敏感性检测极限分别达7.62和1.22×10-1pg/μL。通过对临床36份样品的检测结果表明,该二重PCR检测方法敏感、特异,适合于临床检测应用。

大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因二重PCR技术的建立

为建立一种一次性检测多个磺胺类抗生素耐药基因的检测方法,用磺胺类抗生素耐药大肠杆菌作为受试生物,根据磺胺类抗生素耐药基因Sul1和dfrA1设计一对引物进行二重PCR检测。结果发现:本方法能有效检测出大肠杆菌Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因,检出限为4.5 cfu/μL,对于Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因具有较强的检出特异性。此方法对检测大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因提供了有力的技术支撑。

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7 wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC).人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g.样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100～5.8×100CFU/mL(或CFU/g).试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染.

鸭圆环病毒与鸭Ⅰ型肝炎病毒二重PCR检测方法的建立

目的:建立一种同时检测鸭圆环病毒(DuCV)和鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV)病原体的二重PCR技术。方法:根据DuCV和DHV的基因文库,分别设计了2对与DuCV和DHV某段基因序列互补的引物,用这2对引物对同一样品中DuCV和DHV模板进行二重PCR扩增。结果与结论:用建立的方法均同时得到了2条特异性的大小与实验设计相符(DuCV:245 bp;DHV:569 bp)的二重PCR扩增带,而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性,能同时检出56pg的DHV RNA模板和6 pg的DuCV DNA模板。