毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。

大蕉枯萎病菌二重PCR分子快速检测技术的建立

【目的】基于大蕉枯萎病菌2个不同分化谱系特有的基因序列,建立大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测技术,为该病害预测及有效防控提供理论依据。【方法】基于大蕉枯萎病菌特有的rDNA基因间隔区(IGS)序列设计得到多对PCR引物,分别以广东3个粉蕉枯萎病菌株和8个大蕉枯萎病菌株、2个广西和海南的粉蕉枯萎病菌株、5个其他尖孢镰孢菌菌株和5个外围菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,基于扩增结果从中筛选出大蕉枯萎病菌特异性引物,对其特异性和灵敏度进行检测,并确定二重PCR检测体系的含菌量检测下限。【结果】基于大蕉枯萎病菌特有的基因序列设计得到多对PCR引物,经筛选验证获得2对可用于检测大蕉枯萎病菌2个不同谱系(LineageⅠ和Ⅱ)的特异性引物,可直接应用于大蕉种植土壤和植株中的大蕉枯萎病菌检测,扩增片段分别为755和590 bp。当扩增条带为755 bp时,表明样本中含有大蕉枯萎病菌;当扩增条带为590 bp时,表明样本中含有粉蕉或大蕉枯萎病菌。建立的二重PCR检测体系检测大蕉枯萎病菌菌丝的灵敏度可达0.4μg,检测土壤的含菌量下限为每克土壤40个病原菌孢子。【结论】建立的二重PCR检测技术实现一次PCR反应同时检测并区分大蕉枯萎病菌2个谱系及广东地区的粉蕉枯萎病菌优势菌群,可用于无病大蕉和粉蕉种苗及种植土壤的检测与筛选。