PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。

Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种能同时检测I型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virustype I，DHV—I）和鸭瘟病毒（duckplague virus，DPV）的检测方法，根据GrenBank中DHV-I和DPV的基因保守序列．设计合成两对特异性引物，扩增得到DHV—I和DPV片段，大小分别为399bp和232bp。据此建立了双重PCR检测方法，并将反应条件进行了优化。结果显示，该方法特异性强，能同时扩增出DHV—I和DPV目的条带，而对其他常见的水禽病病原的扩增结果均为阴性。该方法灵敏度高，最低能检出5．3PgI型鸭肝炎病毒和2．7pg鸭瘟病毒的RNA或DNA。采用该方法对在江苏省徐州地区所采集的166份鸭肛拭子进行检测，DHV—I阳性率为1．2％：DPV阳性率为26％。同时。利用该方法对建立的DHV—I和DPV雏鸭感染模型的肝组织和肝组织接种的鸭胚尿囊液进行检测，结果均为阳性．与常规PCR和RT—PCR检测结果一致。上述结果表明。本研究建立的一步法二重RT—PCR方法可以用于DHV—I和DPV快速准确的诊断。

鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。