云南松松塔粗提物体外抗拉沙病毒活性及机制的研究

目的研究云南松松塔粗提物抗拉沙病毒(LASV)活性及机制。方法利用拉沙假病毒系统及拉沙细胞-细胞融合检测松塔粗提物抗LASV活性。其中,构建拉沙假病毒系统以慢病毒骨架质粒PNL-4-3.Luc.R-E.与含有拉沙包膜蛋白质粒转染于293T细胞,生成了一种含有荧光素酶报告基因的假性拉沙病毒。可以在BSL-2级生物安全实验室中检测松塔粗提物抗LASV活性的研究。其次,拉沙细胞-细胞融合模型的构建是通过对已有的质粒进行酶切,连接,鉴定,获得重组质粒,编码带有荧光报告基因及拉沙包膜蛋白的质粒(pAAV-EGFP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)将其转染至293T细胞,获得表面表达有拉沙包膜蛋白的荧光细胞,与靶细胞Huh-7细胞混合铺于96孔板,在37℃,酸性件下发生膜融合,后续用膜融合系统来检测松塔粗提物抗LASV活性研究;对松塔粗提物作用于LASV假病毒感染的具体时期进行分析,通过time of addition及time of remove试验分析松塔粗提物抗病毒作用靶点;采用Western-blot方法检测p24蛋白量,判断松塔粗提物对病毒的裂解作用。结果松塔粗提物可有效抑制LASV感染,用4个谱系的LASV假病毒(LASV lineagesⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)感染靶细胞,测得IC 50值分别为:42.06μg/mL、22.26μg/mL、80.57μg/mL及19.32μg/mL,抑制LASV包膜蛋白(GPC)介导的细胞-细胞融合活性的检测,测得IC 50值分别为:122.9μg/mL、64.43μg/mL、90.05μg/mL及195.6μg/mL;松塔粗提物具有广谱抗病毒作用,可有效抑制沙粒病毒属:淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、卢霍病毒及胡宁病毒假病毒感染,IC 50值分别为:2.72μg/mL、12.02μg/mL、29.95μg/mL;松塔粗提物作用于LASV假病毒感染早期,于感染后2 h内加入粗提物的抑制率明显高于4 h后加入药物,且以阻断LASV假病毒的吸附及融合为主;松塔粗提物对LASV假病毒无裂解作用,提取物处理组测得p24蛋白含量与未处理组无统计学差异。结论本研究证实云南松松塔粗提物在体外环境下可有效抑制LASV感染,且具有广谱抗病毒作用;经试验结果证实松塔粗提物主要作用于病毒感染早期,以阻断病毒的吸附及融合为主,为松塔提取物抗LASV的深入研究提供重要的参考依据。