中国红豆杉细胞经重复诱导和蔗糖饲喂后云南紫杉烷C生产的相应基因表达变化

红豆杉悬浮培养细胞具有可持续生产抗癌药物紫杉醇及其他紫杉烷的潜力。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷C(Tc)是主要的次生代谢产物。为促使代谢前体由生成其他紫杉烷的代谢支路转到生产紫杉醇,实验采用实时定量PCR技术(RQ-PCR)揭示细胞培养过程中紫杉醇及紫杉烷合成关键基因的动态变化。在细胞培养的第7天和第12天,以100μmol/L 2,3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)进行诱导,同时在第7天饲喂20 g/L的蔗糖,在此过程中考察6个关键基因(TASY,TDAT,T5αH,TαH,T10βH和T14βH)的表达变化。上述联合调控手段使得Tc产量在第1次诱导8 d后达(554.46±21.28)mg/L,第2次诱导9 d后高达(997.72±1.51)mg/L。代谢早期基因TASY和TDAT在第1次诱导后表达量分别提高了182和98倍,在第2次诱导后表达量分别提高了208和131倍。在每次诱导后基因表达量提高约持续24 h,之后下降。其他4个基因(T5αH、TαH、T10βH和T14βH)的情况有所不同。基因TαH在2次诱导后表达量分别提高了3 061和1 016倍。其他3个基因T5αH、T10βH、T14βH在第1次诱导后表达量分别提高13、38、20倍,在第2次诱导后分别提高7、16、6倍。RQ-PCR结果表明基因表达和Tc积累之间存在紧密相关性:基因表达的变化与Tc产量的变化相一致,诱导可提高6个基因的表达量。基因的高表达随着培养过程逐渐衰减,再次诱导可再次促使基因的高表达。

原位吸附和茉莉酸甲酯联合使用显著提高中国红豆杉细胞云南紫杉烷c的生产

本实验所用的中国红豆杉细胞悬浮培养体系中,云南紫杉烷c(Tc)是主要的次生代谢产物,该化合物有类神经生长因子活性,提高其产量是进一步规模化生产的前提。本研究考察了原位吸附和茉莉酸甲酯(MJA)联合调控提高Tc产量的可能性。在培养的第7天加入浓度为100μmol/L的MJA虽然会使细胞的生物量下降10%～30%,但是单位细胞内Tc含量和Tc产量均有显著提高,分别是对照的3.6和3.3倍。吸附剂XAD-7在不同时间加入对Tc的合成影响显著。在培养的第7天同时加入100μmol/L的MJA和100g/L的XAD-7会使细胞生物量增加,Tc产量显著提高。培养到第21天,Tc产量达477.4mg/L,为对照的6.3倍,为只加MJA的1.9倍,其中94%的Tc被树脂吸附。实验结果表明,在MJA诱导高表达的过程中,吸附剂XAD-7的加入使细胞内代谢产物外泌,浓度降低,减轻产物反馈抑制现象,从而大幅度提高代谢物产量,有较好的生产前景。

诱导促进中国红豆杉细胞培养中紫杉烷的积累

通过甲基茉莉酮酸酯 ( MJA)或二氢甲基茉莉酮酸酯 ( HMJA)的诱导 ,有效增强了中国红豆杉 ( Taxus chinensis)悬浮细胞培养中新型生理活性物质云南紫杉烷 ( taxuyunnanine C,Tc)的积累。在培养第 7天添加 5 0 0 μmol/L MJA后 ,产物的胞内最大含量为每克干细胞含 2 9.5 mg Tc,但细胞生长受到明显抑制 ;在添加 1 0 0 μmol/L MJA时 ,Tc的总产量达最大 ,为 30 0 mg/L。

脉冲电场对悬浮中国红豆杉细胞的影响

以中国红豆杉悬浮细胞为植物细胞的模型,研究了低频脉冲电场对植物细胞生长和次生代谢的影响.不同生长时相的红豆杉细胞在不同时间的脉冲电场作用下,其生长和紫杉烷积累的情况表现出明显差异.对数前期的细胞经30min的电场诱导后,细胞生长没有明显变化,但紫杉烷的含量提高了近30%.并发现,脉冲电场和补糖的组合策略能更有效地促进细胞积累紫杉烷.

联合调控对中国红豆杉细胞关键酶基因表达的影响

红豆杉悬浮培养细胞可以持续提供抗癌药物紫杉醇及一些紫杉烷类。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷C(Tc)是主要的紫杉烷。为了更理性地调控紫杉醇或有用紫杉烷的生产,有必要深入了解其生物合成过程。采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,即RQPCR)技术考察经调控后紫杉醇及紫杉烷代谢中关键酶基因—TASY,T5αH,TDAT,T10βH,TαH,T14βH表达水平的变化。在细胞培养的第7天和12天,分别以100μmol/L2,3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)诱导,同时在细胞培养第7天进行20g/L蔗糖饲喂、100g/LXAD-7HP的原位吸附。该联合调控处理使得细胞培养第30天时,Tc产量高达1517±37mg/L,是对照处理的11.1倍,是DHPJA重复诱导联合蔗糖饲喂处理的1.7倍。RQ-PCR结果显示:DHPJA的加入可使6个基因表达水平显著提高,但在12小时后快速下降,需补充DHPJA以再次提高基因表达水平。吸附剂同时引入会延缓基因表达水平的提高速度,但却能维持基因表达处于一个较高的水平,表现为在细胞培养中后期,基因表达水平将显著高于无吸附剂的调控体系。与13α-羟化相对应的TαH基因有所不同,吸附剂的存在更显著地抑制其表达,但仍有维持表达的功能。

基于中药整体性的红豆杉抗乳腺癌活性成分筛选方法研究

目的基于中药整体性建立2种红豆杉抗乳腺癌活性成分筛选方法:中空纤维细胞捕获结合高效液相色谱法(HFCF-HPLC)、细胞捕获-分散液相微萃取结合高效液相色谱法(CF-DLLME-HPLC)。方法 HFCF-HPLC是在模拟人体内环境状态下,将人乳腺癌MCF-7细胞种植到聚丙烯中空纤维管腔内部,再将该中空纤维放入红豆杉提取液中,筛选和捕获可以与细胞结合的抗乳腺癌活性成分群;CF-DLLME-HPLC是将MCF-7细胞与红豆杉提取液在细胞正常代谢的基础上共孵育,取不同孵育时间上清液进行分散液相微萃取处理,然后进行不同时间段下色谱分析比对,根据色谱峰变化发现潜在抗乳腺癌活性成分群。结果 HFCF-HPLC筛选出的活性成分是脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、云南紫杉烷;CF-DLLME-HPLC筛选出的活性成分是脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、金松双黄酮。结论 2种方法均可以筛选出有效的抗肿瘤活性成分群,为活性成分的筛选、中药质量的综合评价提供一种方便、普适和高效的新方法。