激活转录因子4与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1互作调控奶牛乳蛋白合成的研究进展

随着国家“双碳”战略的实施,泌乳奶牛的饲粮氮转化效率偏低及由此造成的饲料资源浪费和氮排放增加对我国奶业发展的制约作用日益突出。实际生产中,低蛋白质饲粮基础上补饲特定氨基酸(AA)是提高奶牛饲粮氮转化效率的一项重要举措,但指导其应用的理论基础尚不清晰。已有研究表明,AA补充可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)通路促进乳蛋白的合成,而AA缺乏则通过激活转录因子4(ATF4)抑制mTORC1的活性,且mTORC1又可作用于ATF4影响AA的转运、代谢和乳蛋白的合成。因此,ATF4与mTORC1之间的相互作用为研究限制性AA在低蛋白质饲粮条件下调控乳蛋白合成的机制提供了重要切入点。本文就ATF4与mTORC1互作在平衡AA供应与乳蛋白合成方面的研究进展进行综述,以期为限制性AA调控乳蛋白合成的途径及奶牛低蛋白质饲粮配制提供一定参考。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中,JA(茉莉酸)合成相关基因表达量升高,但是JA信号传递却受到了抑制,推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白,使其活性降低,从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列,为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理,本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测,构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库,并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选,获得了5个来自油菜的互作蛋白:丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物(BnCOP9)、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶(BnDcoH)、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白(BnTSJT1);2个来自核盘菌的互作蛋白:MFS结构域蛋白(SsMFS)和Rho3 GTP酶(SsRho3)。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用,挖掘致病或抗病相关基因,进一步解析其机理奠定了基础。

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10^(7)CFU,次级文库总克隆数为1.6×10^(7)CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10^(7)cells·mL^(-1),酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本研究结果为深入分析棉花非生物胁迫响应的调控网络奠定了良好的基础,为解析GhJAZ1低温应答分子机理提供了重要参考。

小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A转录活性检测及互作蛋白筛选

为了进一步解析小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A的调控机制,本研究对其进行了自激活性检测。利用已构建好的小麦酵母cDNA文库,以TaNRT1.1-1A为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白,回转试验进一步验证其互作关系。结果表明,TaNRT1.1-1A无自激活活性,酵母双杂技术筛选小麦cDNA文库,共获得2个候选互作蛋白,候选蛋白Sdr I-like主要参与植物病害有关的应答响应。Sdr I-like的回转验证结果表明,该蛋白可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。该结果可为进一步研究TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。

羟基-α-山椒素与肌原纤维蛋白互作及其麻味感知机制

花椒中的酰胺类物质羟基-α-山椒素(α-SOH)与蛋白质的相互作用可增强川菜中肉类菜肴的麻味。为明晰肉类加工中二者的结构变化及附着情况,探究热诱导(60,70,90℃)的猪肉肌原纤维蛋白(MPs)与α-SOH的互作机制,并通过分子对接解析α-SOH的麻味激活机制。结果表明,α-SOH可增加α-SOH/MPs复合物的表面疏水性,促进热处理MPs的解聚。α-SOH酰胺基团中的N-H键易与氨基酸残基之间形成稳定氢键,改变蛋白的亚基聚集状态,从而显著减弱SDS-PAGE上大于45 ku的条带。荧光图谱和圆二色谱结果证实α-SOH导致蛋白二级结构由规则向无序状态转变。适度热处理(60℃和70℃)的MPs更易与α-SOH形成复合物,从而降低游离α-SOH含量。分子对接结果显示,α-SOH激活麻味是通过与TRPV1受体上的L681结合产生。本试验阐明MPs与α-SOH的互作机制以及激活麻味的机理,可为肉制品加工中的麻味调控提供理论依据。

甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,PR10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗ShPR10蛋白。为探究ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能,利用同源克隆技术克隆甘蔗ShPR10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析,利用绿色荧光蛋白融合表达法分析ShPR10蛋白的亚细胞定位,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系,采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示,甘蔗ShPR10基因开放阅读框全长570 bp,编码一个不稳定亲水蛋白,蛋白分子量为21.17 kD,等电点为4.77,含有一个P-loop基序,不含跨膜结构域和信号肽。ShPR10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。ShPR10蛋白与玉米ZmPR10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%,两者在进化树上聚为一个分支。ShPR10定位在细胞质和细胞核,与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。ShPR10本身不具有沉默抑制子活性,其表达削弱了P1的沉默抑制子活性,但对P1蛋白的含量无明显影响。综上,ShPR10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性,从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

互作蛋白Nbnrp1参与真菌蛋白激发子PevD1诱导烟草抗病性的功能研究

Pev D1是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌的蛋白激发子,能引起烟草细胞坏死、免疫防御反应和系统抗病性。本实验室前期鉴定了Pev D1的一个互作蛋白Nbnrp1,本研究在此基础上,分析了Nbnrp1在烟草中的表达特征及其亚细胞定位。用RNAi技术获得了Nbnrp1基因沉默株,研究了互作蛋白Nbnrp1在Pev D1诱导烟草抗病性中的功能。结果表明,Nbnrp1在烟草根、茎和叶以及不同生长发育阶段均有表达,定位在烟草细胞核和细胞质中。与野生型植株比较,Nbnrp1沉默植株对Pev D1诱导的细胞坏死反应的程度降低,抗病性减弱,抗病基因PR1-a,PR1-b转录表达水平降低,说明Nbnrp1蛋白参与了蛋白激发子Pev D1诱导的烟草免疫反应和系统抗病性。研究结果为进一步揭示Pev D1诱导烟草抗病机制以及大丽轮枝菌与寄主互作机制奠定了基础。

猪瘟病毒非结构蛋白NS5A与Beclin1相互作用并促进病毒增殖

为探究宿主蛋白Beclin1在猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)非结构蛋白NS5A激活细胞自噬反应过程中的作用及具体分子机制,本研究在感染CSFV及表达NS5A蛋白的ST细胞中,利用qRT-PCR方法检测Beclin1、PI3K/Akt通路相关因子表达变化情况;利用激光共聚焦、Co-IP及GST-pulldown等方法研究Beclin1与NS5A相互作用关系;通过在ST细胞中过表达或敲低Beclin1,研究其对CSFV复制的影响。结果表明,ST细胞感染猪瘟病毒或外源表达NS5A蛋白,Beclin1转录和蛋白表达水平均显著升高,且PI3K/Akt通路相关因子表达水平与之呈正相关。此外,CSFV NS5A蛋白与Beclin1蛋白在细胞中存在共定位且具有相互作用。最后,作者发现在细胞中过表达Beclin1,对CSFV复制起到明显促进作用;反之,利用siRNA敲低Beclin1后,抑制PI3K/Akt通路活化,CSFV增殖表现出明显抑制效应。以上结果表明,Beclin1蛋白对CSFV复制具有促进作用,其机制是通过与NS5A的相互作用调控PI3K/Akt通路来实现。

马疱疹病毒1型gD囊膜蛋白互作蛋白的鉴定分析

旨在筛选并分析与马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白相互作用的宿主蛋白。用免疫共沉淀和LCMS/MS质谱技术鉴定出与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,并进行生物信息学分析。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定到229个与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,对蛋白功能分析发现大多数蛋白与形成细胞骨架有关,细胞骨架不仅能支撑细胞形态,还参与物质运输,结果提示有部分蛋白参与囊泡运输并在其中发挥重要作用,还存在与囊泡形成直接相关的蛋白——网络蛋白重链,为探究EHV-1二次囊膜化的形成过程和研究gD囊膜蛋白与囊泡间的关系奠定了基础。

鸡OATP1B3互作蛋白筛选及其相关基因的转录表达分析

【目的】筛选鉴定鸡有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)的互作蛋白,并探究其对鸡蛋绿壳颜色形成的影响,为提高绿壳蛋鸡群体选育准确性提供参考依据。【方法】以真核表达载体p EGFP-SLCO1B3和空载体pEGFP-C1分别转染绿壳型赤水乌骨母鸡蛋壳腺上皮细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)结合液相色谱与串联质谱联用技术(LC-MS/MS)筛选鸡OATP1B3互作蛋白,经GO功能注释分析、KEGG信号通路富集分析及蛋白相互作用网络分析鉴定出与鸡蛋绿壳性状形成相关的OATP1B3互作蛋白。同时,通过构建SLCO1B3基因沉默及过表达载体分别转染蛋壳腺上皮细胞,检测SLCO1B3基因过表达或沉默时部分OATP1B3互作蛋白基因(FXR1、CTTN、RPL12和RPS17)在蛋壳腺上皮细胞中的表达情况,并根据鸡蛋壳颜色分为白壳、浅绿和深绿3种类型,分析蛋壳颜色△a*值与FXR1、CTTN、RPL12和RPS17基因表达的相关性。【结果】共筛选鉴定出37个与鸡OATP1B3相互作用的蛋白,其中FXR1、CTTN、RPL12和RPS17与鸡蛋的绿壳性状有密切关系。SLCO1B3基因过表达能极显著下调蛋壳腺上皮细胞内FXR1基因的表达(P<0.01,下同),显著上调RPL12基因表达(P<0.05,下同),极显著上调RPS17基因表达;当SLCO1B3基因沉默后,蛋壳腺上皮细胞内FXR1和CTTN基因的表达极显著上调,而RPL12基因的表达显著下调。白壳类型赤水乌骨母鸡下丘脑中的FXR1基因相对表达量极显著高于绿壳类型赤水乌骨母鸡,肝脏中的RPL12和RPS17基因相对表达量极显著或显著高于绿壳类型赤水乌骨母鸡;此外,FXR1基因在下丘脑中的相对表达量与蛋壳颜色△a*值极显著正相关,RPL12基因在蛋壳腺和肝脏中的相对表达量与蛋壳颜色△a*值极显著正相关。【结论】筛选鉴定出的37个鸡OATP1B3互作蛋白主要定位于细胞质和细胞核,具有蛋白结合能力及结构分子活性,主要参与细胞过程、生物调节和能量代谢。在鸡壳腺上皮细胞内SLCO1B3基因与FXR1、CTTN、RPL12和RPS17基因间存在调控关系,其中,FXR1和RPL12基因在鸡蛋绿壳性状的形成过程中发挥着重要作用。

BMP2/SMAD1信号通路在绝经性骨质疏松中的蛋白互作功能

目的通过生物信息学角度挖掘骨形态发生蛋白(BMP)2、Smad同源蛋白(SMAD)1蛋白生信数据,解析BMP2/SMAD1信号通路蛋白互作功能在骨质疏松中发挥的作用及影响。方法基于UniPort数据库进行检索,联合STRING、Ensemble、SWISS-MODEL等数据库,挖掘BMP2、SNAD1理化信息并结合相关文献进行分析。构建BMP2/SMAD1蛋白互作通路等。查询BMP2/SMAD1信号通路在骨质疏松中的表达,利用CNKI、Web of science、万方数据库、Springer、Elsevier SD等数据库检索相关文献。中文检索关键词为“BMP2蛋白、SMDA1蛋白、骨质疏松”,英文检索关键词为“BMP2、SMAD1、Osteoporosis”。排除重复性文献、与主题无关性文献。结果获取BMP2、SMAD1基本信息,绘制分子、生物功能图;构建二元互作蛋白通路图及BMP2/SMAD1信号通路网络图;将糖基化磷脂酰肌醇锚蛋白(RGMB)、血色素沉着(HFE2)、泛素连接酶(SMURF)1、SMURF2、丝裂原活化蛋白激酶分子(MAP3K7)、锌指蛋白(ZNF)521蛋白作为潜在关键位点蛋白进行下一步研究;SMAD家族蛋白作为受体位点在BMP通路中发挥关键作用;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)间接参与BMP2/SMAD1通路调控成骨分化。结论BMP2/SMAD1信号通路中,位于胞外的BMP2蛋白与细胞膜上受体蛋白BMPR1、BMPR2蛋白结合,通过磷酸化激活胞质中SMAD1/5与SMAD4协同调控核内铁代谢;SMAD6/7抑制SMAD1/5协同调控成骨分化表达。在BMP2/SMAD1信号通路蛋白互作网络中,除同族蛋白外,以RGMB、HFE2、SMURF1、SMURF2、MAP3K7、ZNF521为代表的蛋白参与其中,可作为深入研究对象解析BMP2/SMAD1信号通路。在骨质疏松发生过程中,除BMP2/SMAD1信号通路外,包括但不限于MAPK通路的参与,而MAPK的关键作用还有待深究。

羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析

【目的】以羊口疮病毒129(ORFV129)蛋白为研究对象,在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上,通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用SmartTM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129,并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞,验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定,验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析,并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本,采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白(complement C1q binding protein,C1QBP)基因CDS区序列,并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1(+)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-C1QBP,并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库,文库容量约为6.0×106CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129,重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区,长度为837 bp,编码279个氨基酸。系统进化树显示,山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽结构和跨膜结构域,主要包括3种磷酸化位点,分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋(33.81%)、无规则卷曲(46.40%)、延伸链(16.91%)和β-转角(2.88%)组成,三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明,C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP,通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中,推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症,为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。

葡萄VvGAI1与VvJAZ9蛋白互作及低温下的表达模式分析

【目的】DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】以酿酒葡萄品种‘霞多丽’叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】从‘霞多丽’叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为1773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点p I为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草Nt GAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L^(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比,50μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯(Me JA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50μmol·L^(-1)赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应。

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。

盐胁迫下小偃麦酵母双杂交文库构建及TtLEA2-1互作蛋白筛选

【目的】构建小偃麦酵母双杂交(Y2H)文库,筛选胚胎发育晚期丰富蛋白(TtLEA2-1)的互作蛋白,为探究该基因的功能和表达调控机理提供理论参考。【方法】以小偃麦Y1805为材料,经提取RNA、分离mRNA、cDNA合成和均一化(DSN)处理后进行BP(attB和attP位点)重组反应,把重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建cDNA初级文库。抽提初级文库质粒,以pGADT7-DEST载体进行LR(attL或attR位点)重组反应,再转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建Y2H文库。【结果】对初级文库和Y2H文库进行质量分析,其滴度分别是3.98×10^(6) CFU/mL和6.14×10^(6) CFU/mL,库容量分别为7.96×10^(6) CFU和1.23×10^(7) CFU,重组率均为100%。从Y2H文库中挑取的24个单克隆的插入片段长度为850~4000 bp,平均片段长度大于1000 bp。采用Y2H技术和回转验证试验,从小偃麦Y2H文库中筛选了48个可能与TtLEA2-1互作的蛋白。48个TtLEA2-1互作蛋白中,有7个互作蛋白富集在遗传信息处理通路,4个蛋白富集在蛋白质家族:遗传信息过程通路,4个蛋白富集在核苷酸代谢通路,3个蛋白富集在甘氨酸生物合成和代谢通路,2个蛋白富集在碳水化合物代谢通路;富集在蛋白质家族:代谢、细胞过程、环境信息处理、氨基酸代谢通路的蛋白各有1个。【结论】构建的Y2H文库质量高、完整性好和覆盖面广,成功用于小偃麦盐胁迫响应基因互作蛋白的筛选试验,也为新基因发掘及其表达调控机理研究提供高效、便捷途径。

紫心甘薯IbMYB1上游7个调控蛋白的互作与表达分析

【目的】对前期筛选到的紫心甘薯IbMYB1上游7个调控蛋白(IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4和IbEIN3-2)的互作与表达进行分析,进一步阐明花色素苷在特定时空合成与积累的调控网络。【方法】采用酵母双杂交和双分子荧光互补试验,对7个调控因子之间的相互作用进行检测,使用荧光定量PCR对紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期花色素苷合成调控和筛选的上游调控因子进行基因表达特征分析。【结果】IbERF1与IbSCF、IbWRKY1存在相互作用。双分子荧光互补试验证实了酵母双杂交的试验结果。IbERF1基因在紫心甘薯根不同时期的表达量均低于白心甘薯,且随着根中花色素苷的积累其表达量逐渐降低,IbWRKY1和IbSCF基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期中的表达量,与花色素苷的积累无明显的相关关系。【结论】IbMYB1上游调控蛋白IbERF1、IbSCF可分别与IbWRKY1形成复合物,以转录复合体的形式共同调控IbMYB1表达。推测IbERF1可能负调控花色素苷的合成,IbSCF和IbWRKY1参与紫心甘薯花色素苷的合成与调控,可能还存在更为复杂的机制。

不结球白菜BcCHC1蛋白参与调控TuMV侵染的初步研究

【目的】为增强不结球白菜对芜菁花叶病素养(TuMV)的抗性,研究探讨了不结球白菜中BcCHC1蛋白与TuMV之间的相互作用机制。【方法】首先从不结球白菜中鉴定出重链网格蛋白(CHC)基因家族的成员BcCHCs,随后克隆了1个代表性的CHC1基因,并对其进行了亚细胞定位分析。通过双分子荧光互补实验(BiFC)筛选出与BcCHC1蛋白相互作用的TuMV蛋白,并利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)来沉默BcCHC1基因,以评估其功能。【结果】(1)成功克隆了不结球白菜的BcCHC1基因,该基因的编码序列长5124碱基对,编码1708个氨基酸。(2)在TuMV感染不结球白菜30 d后,实时荧光定量PCR分析显示,感染TuMV的不结球白菜中BcCHC1基因的表达量显著降低。(3)亚细胞定位研究表明,BcCHC1蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞核。(4)BiFC实验进一步证实,BcCHC1蛋白能够与TuMV的CI和6K2蛋白发生相互作用,其中与CI的互作主要发生在细胞核内,而与6K2的互作则主要位于细胞膜。(5)通过对BcCHC1基因沉默株系的观察发现,沉默BcCHC1基因会导致植株死亡。【结论】BcCHC1蛋白通过与TuMV的CI和6K2蛋白相互作用,影响网格蛋白依赖的内吞作用途径及病毒复制,从而调控TuMV对不结球白菜的侵染。然而,BcCHC1基因调控TuMV侵染不结球白菜的具体机制仍需进一步研究。

斑马鱼MIB1启动子及互作基因的功能富集分析

目的分析斑马鱼E3泛素蛋白连接酶1(MIB1)基因启动子区转录因子结合位点(TFBS),MIB1互作基因和互作蛋白的种类及其在信号通路中的作用,探讨MIB1基因的调控方式及潜在功能。方法利用国家基因组科学数据中心(NGDC)预测非编码RNA(ncRNA),利用Alggen与AnimalTFDB在线网站预测MIB1基因TFBS种类,使用GeneMANIA与STRING分析MIB1的互作基因与互作蛋白;通过DAVID网站获取相关数据,进行基因本体(GO)可视化分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析。结果MIB1基因启动子区及5′非翻译区可转录出ncRNA;通过预测得到121种TFBS,并发现P53转录因子既可以结合到MIB1基因的启动子区又可与MIB1蛋白相互作用;在线预测出6种MIB1的共表达基因,筛选出20种互作基因;通过GO可视化分析发现,MIB1及其互作基因在生物过程方面具有调控细胞、组织、器官生长分化及调节NOTCH信号通路等功能,且主要在细胞质核周区、细胞膜和突触后密集区等部位被富集,具有结合NOTCH蛋白、PDZ结构域蛋白等分子功能;KEGG代谢通路分析发现,MIB1及其互作基因涉及4条代谢途径。结论MIB1包含多种TFBS,并通过与特定转录因子的相互作用,影响细胞癌变、免疫调节等多种生物学过程。MIB1还可能通过其互作基因和互作蛋白的介导,在细胞生长调控、造血干细胞分化、胚胎发育及神经元信息的传递等方面发挥重要作用。

海马G蛋白偶联雌激素受体1参与癫痫调控的转录组学研究

目的本研究分别将野生型(WT)、Gper1敲低(Gper1-KD)大鼠海马组织进行转录组测序,探讨G蛋白偶联雌激素受体1(G-protein coupled estrogen receptor 1,GPER1)影响癫痫发病可能的信号通路和分子机制。方法海马组织进行RNA提取和cDNA文库构建,与NCBI数据库大鼠基因组及基因注释比对,通过FPKM值,筛选组别间差异表达基因(DEGs)。将DEGs进行GO富集、KEGG富集分析,构建蛋白互作网络,利用RT-qPCR法对关键DEGs进行验证。结果Gper1-KD组与WT组相比,筛选(Fold change>2且FDR<0.01)后,检测到DEGs 2253个,其中上调基因1380个,下调基因873个;GO结果显示,DEGs主要分布在淋巴细胞趋化性、细胞分泌、巨噬细胞趋化性、中性粒细胞趋化性、血管生成正向调控等生物过程;KEGG结果显示,DEGs相关分子信号通路主要有癌症信号通路、PI3K-Akt通路、癌症蛋白聚糖相关信号通路、细胞黏附相关通路、MAPK信号通路等;RT-qPCR结果表明,Mapk12、Pdpk1、Foxo3、Camk2d、Pik3cg等基因表达水平差异具有显著性。结论MAPK、TNF信号通路在GPER1影响癫痫发生中可能起关键作用,GABA能神经元和Pik3cg在GPER1影响癫痫易感性方面可能发挥重要作用。