五唇兰菌根化育苗技术

为探索菌根技术在兰科植物保育中的应用,以野生五唇兰的内生菌根真菌和五唇兰组培苗为材料,进行组培瓶苗和盆栽苗的菌根化研究。利用固体培养的菌丝体与五唇兰无菌组培苗进行共生培养,15d后,根染色法检测结果表明,真菌能够成功侵染根,菌根化苗的移栽成活率均达到100%(对照为63.33%)。种植90d后各菌株处理苗的鲜样质量增长率均高于对照,其中F29菌株处理苗的鲜样质量增长率高于对照31.3%。在大棚栽培条件下,利用液体菌剂对盆栽苗进行菌根化培养。90d后各菌株处理苗的成活率和鲜样质量增长率均高于对照,其中F29菌株处理成活率比对照高出35%,鲜样质量增长率比对照高33.24%。

五唇兰雌配子体发育和胚胎发生的研究

五唇兰（DoritispulcherrimaLindl．）的胚珠倒生型，具薄珠心，两层珠被．胚囊发育为双孢子葱型，成熟胚囊8核．从传粉到受精约50d,正常双受精．胚具5－6细胞的胚柄，种子成熟时胚柄及胚乳核消失，成熟种子只具单层细胞的种皮和一个未分化的珠形胚．

五唇兰大孢子发生的超微结构观察

五唇兰(DoritispulcherrimaLindl.)大孢子母细胞在减数分裂前呈长圆形,细胞核偏向珠孔端,细胞呈现极性分化。大孢子母细胞第一次减数分裂形成二分体。随后,二分体珠孔端的一个细胞退化,合点端的一个细胞体积增大成为功能大孢子。功能大孢子进行第二次减数分裂,形成二核胚囊。这一过程属于双孢子葱型胚囊的大孢子发生类型。珠孔端的二分体细胞(大孢子)在退化过程中质膜保持完好,液泡数量增多,染色质高度凝集,具有细胞程序死亡的部分特征。功能大孢子的细胞器和染色质分布均匀。功能大孢子合点端的细胞壁上有发达的胞间连丝,二核胚囊期胞间连丝消失。在功能大孢子靠近合点端一侧有吞噬结构,其内含有结构模糊的细胞器。

五唇兰种子离体培养的研究

授粉90d的五唇兰种子95%具球形胚,无菌条件下播种于培养基3个月后种子最高萌发率达到 90%。ABA和高浓度的NH4NO3抑制种子的萌发。NAA和BA促进种子的萌发,最适浓度为BA0.2mg· L 1+NAA0.5mg·L 1。400mg·L 1的谷氨酰胺可促进原球茎生长。2000mg·L 1的蛋白胨促进原球茎发 育成苗。

五唇兰两种生态型的光合特性研究

以叶背绿色型和叶背紫红型两种五唇兰(Doritis pulcherrima)生态型的组培苗为试材,进行叶片CO2吸收的日动态变化、气孔密度及光合色素的测定进行分析研究。结果表明:五唇兰属于CAM(景天酸代谢途径)植物;叶背绿色型的CO2吸收速率大于叶背紫红型;两种生态型的气孔密度没有显著性差异;两种生态型的总叶绿素含量、叶绿素a(Chl a)含量、叶绿素b(Chl b)含量、叶绿素a与叶绿素b的比值、类胡萝卜素(Car)含量也均没有显著性差异,但胡萝卜素与总叶绿素(Chl)含量的比值则有显著性差异。五唇兰的光合特性及叶片光合色素含量,体现了其作为一种热带兰对生长环境的高度适应性。

不同生境下五唇兰根部可培养内生细菌多样性研究

兰科植物内生细菌与菌根真菌的协作对宿主植物的生长、抗病、抗逆及植物修复环境能力等具有重要意义,揭示其内生细菌多样性及与生境之间的关系有助于阐明兰科植物的适应与进化机制。本研究基于16SrDNA序列分析探讨了不同生境下东南亚特有种五唇兰根部可培养内生细菌多样性及其空间异质性。结果表明:从不同生境下五唇兰根部共分离出内生细菌59株,其中从土生型五唇兰根部分离出内生细菌45株(76.27%),从石生型五唇兰根部分离出内生细菌14株(23.73%);基于内生细菌16SrDNA序列同源性分析及构建的系统发育树显示,五唇兰根部内生细菌分属于7属,即芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、草酸菌属(Pandoraea)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、欧文氏菌属(Erwinia),其中优势属为芽孢杆菌属,次优势属为泛菌属和伯克氏菌属;多样性分析显示,土生型五唇兰根部内生细菌群落的Shannon多样性指数大于石生型五唇兰,不同生境下五唇兰根部内生细菌群落结构差异极显著(P<0.01)。土生型五唇兰根部内生细菌群落优势属为芽孢杆菌属和泛菌属,石生型五唇兰根部内生细菌群落优势属为芽孢杆菌属和伯克氏菌属。

不同营养液对水培五唇兰生长发育的影响

对五唇兰进行水培试验,分析了5种营养液对五唇兰植株生长和发育的影响,结果表明五唇兰可以进行水培。在水培条件下,五唇兰根系进行适应性生长,新根可以从老根上长出,也可以直接从根状茎上长出。在配方V中五唇兰成活率最高,在配方III中增殖率和平均花朵数最多,因此在进行五唇兰水培产业化生产时,营养液不宜单一化,建议小苗采用配方Ⅴ培养,中苗及大苗采用配方Ⅲ培养,同时可用配方Ⅲ作为叶面追肥。

菌根化五唇兰组培苗的光合生理特性

为探索兰花内生真菌在兰科植物生长发育中的效用,以野生五唇兰中分离并初步筛选的内生菌根真菌为接菌剂,对五唇兰无菌组培苗进行菌根化苗盆栽试验,试验采用液体培养的菌液进行根部喷施,待菌根化苗生长18个月后测定其成活率及光合生理等指标。结果表明:接菌明显提高了五唇兰幼苗成活率,促进了光合速率(Pn)、气孔导度(Cond)、蒸腾速率(Tr)及叶绿素含量和叶面积的增加,并降低了胞间CO2浓度(Ci),以接dmf-49菌处理效果最明显,但五唇兰光合速率不高,在1.50μmol·m-2·s-1以下。表明从野生五唇兰中分离并初步筛选的有效内生真菌能提高其菌根化苗的光合能力,提高植株的生活力。

五唇兰受精过程中卵细胞的响应

五唇兰Doritis pulcherrimaL ind l.受精过程中超微结构观察结果显示:精子到达胚囊前,卵细胞呈梨形;精子到达胚囊时,卵细胞呈典型的倒梨形;精核和卵核融合时,卵细胞呈长圆型,卵核凹陷,整个精核被卵核包围着。由此可见:五唇兰受精过程的顺利进行,不仅需要精细胞的主动参与,还要卵细胞的积极响应。

五唇兰非致病真菌的特性及对组培苗生长的影响

以从野生五唇兰植株上分离筛选到的非致病真菌为研究对象,根据形态特征进行种类鉴定,用羧甲基纤维素钠培养基和无机磷培养基进行培养,筛选出具有解纤维和解磷能力菌株,再将菌株接种到五唇兰组培苗上。结果表明:在14株五唇兰非致病真菌中,同时具有解纤维和解磷能力的菌株共10个;除R06和R09菌株外,其余菌株对五唇兰组培苗生长均有促进作用,其中RH18、R03和R14菌株处理的五唇兰组培苗鲜重增长率极显著高于未接菌对照,RH19、R02和S02菌株处理的五唇兰组培苗鲜重增长率显著高于未接菌对照,R05和R002菌株处理与未接菌对照无显著差异。

2种不同叶背色五唇兰的核型比较分析

采用常规压片法对2个不同叶背色的五唇兰进行染色体数目和核型比较分析。结果表明:2种叶背色五唇兰的染色体数目均为2n=38,核型类型均为"1B"型,二者同为一个种。其中,绿叶五唇兰的核型组成公式为2n=2x=38= 30m+8sm,核型不对称系数为58.02%;红叶五唇兰的核型组成公式为2n=2x=38=34m+4sm,核型不对称系数为57.17%。两者主要由中部着丝粒染色体和近中部着丝粒染色体组成,无随体染色体,且以红叶五唇兰的核型较为原始。

五唇兰生物学特性及试管繁殖的研究

五唇兰为我国自有的亚热带附生兰，数量稀少，甚为罕见。本文叙述了它的生物学特性，野生幼苗驯化栽培和组织培养。五唇兰的组织培养国内外未见报道，五唇兰组织培养的成功有助我国稀有兰种资源的开发利用。

五唇兰精细胞的分离

五唇兰(Doritis pulcherrima)具二胞花粉,授粉后1 d即有花粉开始萌发,授粉后5 d开始有生殖细胞完成有丝分裂形成一对精细胞。通过人工授粉使花粉管在子房内发育,再利用花粉管直接爆破,成功分离出五唇兰的精细胞。成对的2个精细胞在直径大小、荧光强弱上均显示出较大差异,预示2个精细胞具有不同的前途。

五唇兰未受精胚珠离体培养及雌配子体发育的研究

五唇兰(Doritis pulcherryma Lindl.)的胚珠属于倒牛型，具薄珠心，两层珠被。胚囊发育类型为双孢子葱型，授粉后约45d形成L细胞八核的成熟胚囊。五唇兰未受精胚珠在离体培养初期对外源激素的依赖性很小，在没有外源激素的培养基上，大孢子母细胞也能经过减数分裂发育为．二核胚囊。在培养后期，外源激素对胚囊发育的影响很大。在培养基无外源激素或仪含生长素或细胞分裂素时，雌配子体的发生过程不能顺利完成；在改良VW培养基上添加0．5mg/L BA和0．1mg／L NAA时，形成成熟胚囊。

五唇兰的分株繁殖研究

[目的]为野生兰花五唇兰(Doritis pulcherrima Lindl.)推广繁殖提供参考。[方法]以泥炭+塑料泡沫为基质,进行五唇兰的分株繁殖试验,于分株后40、90和300 d观察分株苗的生长发育、开花和新苗增殖情况。[结果]五唇兰分株苗成活率可达95%以上。分株当年假鳞茎可以抽出花葶,开花率达到92.3%;分株次年根状茎上新苗增殖率可达2.9倍。[结论]分株可作为五唇兰推广繁殖的有效途径。

五唇兰根部内生细菌的筛选及其促生活性

以野生五唇兰植株根部中分离出的15株内生细菌为研究对象,将其接入五唇兰组培苗中进行共培养,研究其对组培苗的促生影响并分析其固氮、溶磷和产IAA能力等促生活性。结果表明,15株内生细菌中有11株对五唇兰组培苗有促生作用,其中,Paenibacillus graminis(TW2-1)对五唇兰组培苗有显著的促生影响,促生效果最佳。15株内生细菌中,9株具潜在固氮能力;10株具产IAA的能力,其中Bacillus cereus(TW1-4)产IAA能力最强;7株具溶解无机磷能力,Bacillus megaterium(TW1-1)溶磷量最高,内生细菌的溶磷能力与其产酸能力呈正相关。

五唇兰珠被细胞的超微结构观察

应用透射电镜对五唇兰(Doritis pulcherrima)珠被细胞进行超微结构观察。结果表明,授粉 38d 后,五唇兰外珠被细胞尚保持完好,而内珠被细胞开始退化;线粒体内嵴减少或消失,内质网上的核糖体数量减少,液泡增加,在新形成的液泡内含有膜状结构和模糊的细胞器,但核膜完整,与细胞程序死亡的部分特征相似。

五唇兰的组织培养和快繁技术研究

目前野生兰花资源不断减少,部分品种濒临灭绝;本项研究是从野生五唇兰植株直接切取茎尖进行离体组织培养,以五唇兰试管苗的原球体和幼苗作为试验材料,在13种培养基上进行增殖快繁与生根试验。结果表明,M4是有利于外植体诱导形成原球茎的培养基,M6是有利于原球体增殖生长的培养基;M9是既适于原球体增殖生长又适于幼苗根生长的培养基;M12是幼苗生根最适的培养基,在同一栽培基质中,试管苗经过斜射太阳光炼苗60d左右,污染率较低且移栽成活率较高。

五唇兰胚胎发生与几种同工酶变化的相关性研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法研究了五唇兰(Phaius tankervilliae Lindl.)授粉后合子形成过程中同工酶的变化情况。结果发现,有些位点在这一发育过程中始终表达,如Est-2、Est-4、AAT-3;球形胚形成时,Est-1、Est-3消失;Pgi-3只在合子形成时出现。同工酶位点的变化说明五唇兰受精后合子的形成是相关基因时序性表达的结果。

五唇兰双胚囊的观察

应用石蜡切片法对五唇兰(DoritispulcherrimaLindl.)的胚囊发育过程进行了观察,结果表明:五唇兰的胚囊发育类型为双孢子葱型,胚珠通常含单胚囊,也形成约1%的双胚囊.双胚囊胚珠和正常发育的胚珠一样呈倒生型、具薄珠心、两层珠被,但胚珠横轴与纵轴的比值是正常胚珠的1.3-2倍,同一胚珠内的两个胚囊发育不一定同步.