五指山猪MYH基因家族结构变异对背最长肌肌纤维性状的影响

旨在通过探究五指山猪背最长肌MYH基因家族结构变异(SVs)对背最长肌肌纤维性状的影响,为深入理解肌纤维生长规律和分子机制提供基础。研究对象为五指山猪,采用大白猪作为对照组。屠宰前一周将3头五指山猪(4月龄母猪,平均体重14.2 kg)和3头大白猪(4月龄母猪,平均体重58.0 kg)饲养在相同的环境中,饲喂充足的食物和水,所有猪饥饿处理24 h之后屠宰。采集6头猪背最长肌组织,提取完整DNA,PacBio平台建库测序,每个样本测序大约40 Gb,测序数据与参考基因组(Sscrofa 11.1)比对,使用Sniffles和PBSV软件的默认参数检测SVs,过滤条件:50 bp≤SVs≤10 kb;提取每头猪背最长肌总RNA,转录组测序,计算基因表达量;统计五指山猪和大白猪SVs在染色体上分布位置和数目,比较五指山猪相对于大白猪SVs差异,筛选五指山猪特异性SVs,构建五指山猪MYH基因家族系统发育树,预测结构域,分析MYH基因表达量与肌纤维指标相关性。结果表明:1)五指山猪共有7个特异性MYH基因,主要分布在第3、5、6、12、13号染色体,第12号染色体包含3个MYH基因;2)系统进化树显示,五指山猪7个MYH基因分化为2个分支,分别编码非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白,MYH9与MYH11基因、MYH1与MYH4基因同源性最高;7个MYH基因都包含结构域Motor domain,5个MYH基因包含结构域Myosin-N,MYH基因头部结构域(Myosin-N和Motor domain)相对保守,中间和尾部结构域差异较大;其中五指山猪MYH1、MYH4和MYH9基因包含SVs而大白猪没有SVs,皮尔森系数统计表明,MYH基因是否包含SVs可能与基因表达量相关;综合转录组测序和Q-PCR试验,检测这3个MYH基因的表达量与肌纤维指标相关性,MYH1基因表达量与肌纤维密度和数量正相关,MYH4基因表达量与肌纤维密度和数量负相关,MYH9基因表达量与肌纤维密度负相关,与直径正相关。综上所述,五指山猪第12号染色体上特异性MYH基因最多;MYH基因家族主要分化为非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白2个分支;MYH蛋白头部结构域相对保守,中间和尾部结构域差异可能是造成MYH基因家族分化的主要原因;MYH1、MYH4和MYH9基因表达量均与肌纤维密度相关,可能通过调控背最长肌肌纤维密度影响肌肉生长发育。本研究不仅扩展了肌纤维生长发育的分子机制相关内容,也为优化结构变异有关的遗传育种模式提供借鉴。

五指山猪二尖瓣间质细胞的分离、培养与鉴定

黏液瘤样二尖瓣疾病(MMVD)是哺乳动物最常见的心脏病之一,临床上可引发心力衰竭和猝死,目前该病的发病机制尚不完全明确。在MMVD发生发展进程中,二尖瓣间质细胞(MVICs)活化引起的细胞外基质重塑是本病的关键病理变化。因此本研究拟通过建立五指山猪原代MVICs分离、培养体系,获得可稳定培养的MVICs,为MMVD相关研究提供体外研究细胞材料。结果表明,用目前方法分离得到的五指山猪二尖瓣细胞呈CD31阴性、Vimentin阳性,符合MVICs特点。对比添加不同浓度血清的培养基,含10%胎牛血清(FBS)的完全培养基对MVICs细胞增殖活力更有利,可支持MVICs在体外稳定培养至少20代。本研究获得的五指山猪原代MVICs可为二尖瓣疾病病理机制研究与进一步的靶向药物开发提供体外研究平台。

海南五指山猪遗传多样性的微卫星分析

海南五指山猪 (Wuzhishanpig)是我国珍稀的小型猪品种。它的解剖学、生理学、疾病发生机理等都与人类极其相似 ,具有重要的应用价值 ,可用于心血管病、皮肤烧伤和新药评价等许多方面的研究。作者利用多重PCR和基因扫描技术对五指山猪 32个微卫星基因座进行了遗传检测。统计了全群、核心群和近交群的等位基因组成 ,并计算了它们的平均纯合率、多态信息含量 (PIC)和平均杂合度。结果显示 ,全群、核心群和近交群 32个基因座的平均等位基因数分别为 14 .5 90个、9.4 10个、13.6 6 0个 ,平均基因纯合率分别为 4 4 %、4 4 .3%、4 4 % ,平均PIC分别为0 .74 2、0 .70 8、0 .731,平均杂合度分别为 0 .5 6 0、0 .5 5 8、0 .5 5 9。这表明海南五指山猪虽然遗传基础比较稳定 ,但仍具有较大的遗传变异。上述结果对于海南五指山猪的保种、定向选育。

五指山猪与长白猪胴体性状和肉品质的比较研究

本试验对五指山猪和长白猪胴体性状、肉质性状、背最长肌氨基酸和脂肪酸含量进行了分析,旨在探讨五指山猪肉和长白猪肉的肉品质差异。结果表明,长白猪宰前重、胴体直长、胴体斜长、屠宰率、眼肌面积、平均背膘厚及瘦肉率均极显著高于五指山猪(P<0.01);五指山猪肌内脂肪含量极显著高于长白猪(P<0.01),pH、熟肉率、滴水损失和剪切力差异不显著(P>0.05);五指山猪肉的鲜味氨基酸、必需氨基酸、饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量均极显著高于长白猪(P<0.01)。因此,五指山猪肉品质优于长白猪。

应用多重PCR和基因扫描技术对五指山猪13个家系32个微卫星基因座的遗传分析

五指山猪是我国著名的珍稀畜种,体型小、性成熟早、遗传稳定、近交程度高,可用于医学、药学和生物材料等方面。利用多重PCR和基因扫描技术对五指山猪13个家系的32个微卫星基因座进行遗传检测。统计各家系的等位基因组成,计算各家系的平均杂合度和多态信息含量(PIC);结果显示,各家系32基因座的平均等位基因数为13 66个,平均PIC为0 731,平均杂合度为0 559。表明海南五指山猪具有丰富的遗传多样性。这些结果对于海南五指山猪的保种、定向选育、开发利用都具有重要的指导意义。

五指山猪近交系群体中DRA和DRB基因的SSCP检测

为确定五指山猪(WZSP)近交系群体SLA!ⅡDRA、DRB基因的等位基因数及其特性,利用PCR扩增SLA!ⅡDRA、DRB基因的第2外显子序列,经单链构象多态性即SSCP检测其等位基因数,选择纯合子个体的PCR产物直接测序。对所获得的序列与Genbank中所有相应的序列进行比对和聚类分析,特别是SLA!DRB!C、SLA!DRB!D、HLA!DRB*09012、HLA!DRB*1201、HLA!DRA*0101等位基因。结果表明:在WZSP近交系群体中,DRA、DRB各有2个等位基因且发现1个DRB新等位基因。DRA第2外显子有很强的保守性,而DRB基因呈现出高度的多态性,在核苷酸水平同源性为85%以上,氨基酸水平同源性为70%以上。该试验成功地检测了WZSP近交系SLA!DRA、DRB基因的等位基因及其特性,为建立WZSPSLA!DR基因抗原的分子分型及特异单倍型猪的培育研究奠定基础。

五指山猪GH、IGFBP3基因SNPs检测及与生长性状的关联分析

以五指山猪为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合技术,对GH基因和IGFBP3基因进行多态性检测,并分析其与生长性状(体质量,体高,体长和胸围)的相关性。结果表明,GH基因第2外显子存在一处G→A转换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,BB基因型的体重显著高于AA基因型和AB基因型;IGFBP3基因第2外显子存在一处G→C颠换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型的体高显著高于BB基因型;IGFBP3基因第4内含子存在一处碱基C缺失,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型体重显著高于AB基因型和BB基因型。研究将为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面研究提供了遗传学依据。

五指山猪IGF2基因5'调控区单核苷酸多态性分析

利用PCR产物直接测序法,对五指山猪、滇南小耳猪、香猪、梅山猪和大白猪共60个样本的IGF2基因5'调控区部分片段的单核苷酸多态性进行了研究。找到13个SNP,分别是:C5872T、C5888T、A5976G、C6010T、T6029A、C6037T、C6043T、C6063T、C6112T、C6164T、G13520A、G13563A和G13669A。T6029A为T←→A碱基颠换,A5976G、G13520A、G13563A和G13669A为A←→G转换,其他均为C←→T转换。针对13个SNP位点得到23种组合基因型。统计各位点等位基因和基因型以及各组合基因型在总群体与各品种内的分布频率,发现3个小型猪在A5976G、C6164T和G13669A位点上的优势等位基因均分别为G、T和A,而梅山猪和大白猪的优势等位基因均分别为A、C和G;H19型为3个小型猪的特征组合基因型,而另两个猪品种为H15型。同时对123头五指山猪IGF2基因C5888T位点进行了PCR-RFLP分析,研究表明该位点C为优势等位基因(0.8536),CC为优势基因型(0.7235)。卡方检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。这些结果可为五指山猪等小型猪的生长发育规律、矮小机制等方面的研究提供遗传学依据。

五指山猪不同组织中Myf5与MyoD1基因的表达研究

MRFs家族成员包括Myf5、MyoD1、Myf4和Mfy6,利用Real-time PCR技术,检测Myf5、MyoD1基因在从出生到体成熟(30d、210d、360d)五指山猪背部肌肉组织中的表达变化趋势,以及Myf5、MyoD1基因在体成熟五指山猪心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、肌、胃和小肠以上组织中的mRNA表达水平。结果表明:Myf5和MyoD1基因在出生后五指山猪背部肌肉组织中的mRNA表达水平与五指山猪的生长年龄成正比(P<0.05);Myf5及MyoD1基因在成年五指山猪以上8种组织中均有表达,其中在肌肉组织中相对表达量最高。

Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中的表达

本研究采用免疫荧光及免疫组化DAB显色技术来检测Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的骨骼肌中的定位和表达情况,并通过平均光密度统计分析Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪骨骼肌中表达水平。结果表明:Myogenin蛋白表达定位于骨骼肌细胞核表达;在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的腿部骨骼肌和背部骨骼肌中均检测到阳性产物,在猪胎儿期间骨骼肌中Myogenin蛋白的表达水平高于其在成熟猪骨骼肌中的表达;且在同种猪腿部骨骼肌中的表达水平显著高于其在背部骨骼肌中的表达;此外还检测到Myogenin蛋白在五指山猪骨骼肌中表达均显著高于其在长白猪骨骼肌中的表达(p<0.05)。本研究得到的Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中存在显著的表达差异结果,为今后研究不同猪种间骨骼肌发育差异及探讨五指山猪矮小机制和发育机理提供了理论基础。

五指山猪不同组织中肌细胞生成素基因Myf4及生肌调节因子Myf6的表达

本文通过运用Real-time PCR技术,检测肌细胞生成素基因Myf4和生肌调节因子Myf6在出生后的第30天、第210天、第360天(出生到体成熟)的五指山猪肌肉组织中的表达变化,以及Myf4、Myf6在体成熟五指山猪肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠组织中mRNA相对表达情况。结果表明:Myf4及Myf6基因在五指山猪出生后在肌肉组织中的mRNA表达水平随着五指山猪的生长年龄生长而显著增长(p<0.05);Myf4及Myf6基因在成年五指山猪以上8种组织中均有表达,其中在肌肉组织中相对表达量最高。本研究结果将为五指山猪肌肉生长发育及矮小性状形成机理提供参考。

五指山猪精液冷冻保存研究

试验利用液氮熏蒸法进行颗粒冻精,以1组冷冻保护液为对照,2组,3组冷冻保护液以氨基酸代替部分糖类物质,以解冻后的精子活力、活率和顶体完整性为判断标准,比较了4种冷冻保护液及不同冷冻-解冻程序对五指山猪精液冷冻的影响。结果表明:解冻后精子2组,3组的3个判断标准均显著高于1组(P<0.05);4组(2.5 mL DMSO)冷冻保护液解冻精子的活力和活率显著低于2组(2 mL甘油)和3组(1.25 mL DMSO+1 mL甘油)(P<0.05)。精清保留量为0 mL/10 mL时解冻精子的活率和活力显著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10 mL(P<0.05)。干解法解冻后精子活率显著高于湿解法(P<0.05)。

五指山猪资源现状、保护及开发利用

五指山猪在解剖学、生理学、病理学等方面与人类有较大的相似性,是开展生态特色养殖、杂交改良和人类比较医学研究的理想猪种。但由于其受自身生长速度缓慢、繁殖率低、饲养成本高及外来猪种充斥的影响,曾一度处于濒临灭绝状态。随着近年来政府对地方猪种保护力度的加强和人们对优质肉食品需求的增加,五指山猪产业也得到了一定程度的发展。为了更好的保护和利用五指山猪种质资源,论文从五指山猪种质特性、资源现状、存在问题及综合利用等方面进行了阐述,并提出了相应的保护和可持续发展建议。

能量来源对五指山猪生长性能、初情期日龄及子宫和卵巢组织发育的影响

为了研究不同能量来源对五指山猪生长性能、初情期日龄及子宫和卵巢组织发育影响,本试验选用30头体重接近的五指山断奶仔猪,随机分为3组,试验猪分别饲喂添加5%木薯淀粉、3%椰子油和3%椰子油+0.8%亚麻籽粉的日粮,分析了生长性能、子宫以及卵巢组织发育等相关指标。结果表明,椰子油组和椰子油+亚麻籽粉组显著增加5kg~初情期猪平均日增重(P<0.05)。日粮中添加椰子油可显著增加初情期背膘厚度(P<0.05),及早启动后备母猪初情期,比椰子油+亚麻籽粉组和木薯淀粉组分别提前了(9±3.1)d和(8±1.8)d(P<0.05)。与其它两个组相比,椰子油可显著增加五指山猪子宫重(P<0.05)、子宫角和子宫体长(P<0.05)。椰子油和椰子油+亚麻籽粉组组输卵管长度(P<0.05)显著高于木薯淀粉组,椰子油+亚麻籽粉组大卵泡数(P<0.05)显著高于椰子油组和木薯淀粉组。结果提示,富含椰子油日粮可显著提高五指山猪生长性能、及早启动初情期、促进卵巢和子宫组织发育,而富含亚麻籽日粮可显著促进母猪排卵。

Kiss-1/GPR54系统在不同发育阶段五指山猪下丘脑中的表达

采用荧光定量技术研究Kiss-1mRNA和GPR54mRNA在30、60、90(初情期)和120日龄五指山母猪下丘脑表达情况,并检测血清中FSH、LH、E2、P4浓度变化。结果表明:初情期前,Kiss-1mRNA表达量随着五指山猪年龄的增长逐渐升高,到初情期(90日龄)时表达量达到最高(P<0.05),120日龄(初情期后)时表达量逐渐降低(P<0.05)。GPR54mRNA表达不受影响。血清FSH、LH、E2、P4浓度变化的趋势大体一致,初情期前各激素水平逐渐升高,但差异不显著(P>0.05);至初情期(90日龄)时显著升高,且达到一个峰值;血清FSH、LH和E2浓度在90日龄和120日龄时差异不显著(P>0.05),P4浓度在90日龄时显著高于120日龄(P<0.05)。结果显示:Kiss-1基因是五指山猪初情期启动的关键因子。

五指山猪小群体遗传学检测

本研究利用26个微卫星基因座对中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所保种场的五指山猪小群体58个样本进行了遗传学检测,用非变性(中性)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星的PCR扩增产物,统计了群体平均基因纯合率、等位基因数,利用等位基因频率计算出各群体的平均遗传杂合度(H)、多态信息含量(PIC)。统计结果:全群平均基因纯合率为66.5%;平均多态信息含量、平均观测杂合度为、平均期望杂合度分别为0.807、0.338、0.835;每个位点平均等位基因数为11.92,此结果说明该群体虽然近交程度较高,但仍具有丰富的遗传多样性,遗传变异较大。

Kiss-1基因在不同发育阶段五指山猪睾丸中的表达及定位研究

试验采用荧光定量技术研究亲吻素-1(Kiss-1)基因mRNA在30、60、80(初情期)和120日龄五指山公猪睾丸中的表达情况,并采用免疫组化技术定位其表达。结果显示,Kiss-1mRNA在五指山猪睾丸中的表达随着年龄的增长表达量逐渐升高,到初情期(80日龄)时达到最高(P<0.05),随后到120日龄时显著降低(P<0.05);免疫组化结果显示,睾丸间质细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞及间质细胞中均发现Kiss-1阳性反应产物,而在精子中未发现Kiss-1阳性表达产物。结果证实,Kiss-1基因在五指山猪精子发生过程中发挥着重要作用。

五指山猪线粒体基因组全序列测定与分析

采用PCR及TA克隆测序技术,获得五指山猪线粒体基因组全序列(KJ909516),并对其特征进行具体分析。结果表明,五指山猪线粒体基因组序列全长16 689bp,碱基组成为A(34.7%)、C(26.2%)、G(13.3%)、T(25.8%),包含13个蛋白编码区,2个rRNA,22个tRNA和1个非编码控制区(D-Loop区)。13个蛋白质编码基因中,ND2、ND3和ND5起始密码子为ATA,ND4L起始密码子为GTG,其余均为ATG。蛋白编码基因ND1和ND2终止密码子为TAG,Cyt b终止密码为AGA,COXⅡ、COXⅢ、ND3和ND4的终止信号为不完全密码子T,其余均为TAA。22个tRNA中除tRNASer(AGY)缺少DHU臂外,其余tRNA均可形成典型三叶草结构。线粒体控制区全长1 254bp,含有22个长度为10bp的串联重复序列ACGTGCGTAC。5种中国小型猪蛋白质编码基因的比对结果说明,五指山猪在ND2和ND5基因上与其他4个猪种存在明显差异,可为能量代谢差异研究提供分子学依据。

五指山猪8种组织IGF2和IGFBP3基因表达的发育性变化研究

采用Q-PCR技术检测了胰岛素样生长因子2(IGF2)和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)基因在30、60、90、120和150日龄五指山猪心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、肌肉、胃脏和小肠等8种组织中的mRNA表达水平。结果表明:(1)IGF2基因在8种组织中的表达呈相似的变化规律:各组织mRNA表达量随着日龄的增加而降低,30日龄时表达量最高,150龄时表达量最低,差异显著(P<0.01);(2)IGFBP3基因在心脏、肺、脾脏、肾脏、肠、胃等组织中的mRNA表达规律相似:即从30～150日龄,依次递减;而肝脏和肌肉mRNA表达从30日龄开始上升,肝脏在90日龄达最高,肌肉在60日龄时达最高,随后二者开始下降,在150日龄时达最低水平。以上结果初步揭示了五指山猪IGF2和IGFBP3基因表达的发育性变化模式,为深入研究五指山猪生长发育及矮小性状形成机理提供了基础数据。

基于RNA–Seq五指山猪背最长肌基因表达差异分析

为完善五指山猪基因结构和发掘新基因,采用转录组测序(RNA–Seq)技术对6、8月龄五指山猪背最长肌组织转录组进行分析。经过质量控制,分别得到65 683 578条(6月龄)和65 464 156条(8月龄)有效序列;与猪基因组比对后发现,转录本序列分别为20 102、25 719个;通过与各数据库进行序列对比,功能基因分别有18 206、18 374个;朋6、8月龄五指山猪样品中预测的新转录本分别有687、737个,长度为180~14 884 bp,新转录本最少的仅含有1个外显子,而最长的包含40个外显子;新预测的可变剪接分别有28 670、32 940个,内含子保留(intron retention,IR)模型在6月龄五指山猪中的数量最多,而在8月龄猪中却以外显子跳跃(skipped exon,SE)剪切模型为主;对6 932个(6月龄)和7 110个(8月龄)基因结构进行优化,分别有2 785、2 950个基因3'端发生了延伸,4 147、4 160个基因5'端发生了延伸;分别筛选出103 250个(6月龄)和110 545个(8月龄)SNP位点,均以转换型SNP位点数量居多。