五羟色胺-N-乙酰转移酶基因真核表达载体的构建表达及活性检测

目的构建pTARGETTM-AANAT真核表达载体并转化L6成肌细胞,检测目的基因的表达并初步探讨AANAT转基因细胞的生物活性。方法提取大鼠松果体组织mRNA,RT-PCR技术扩增五羟色胺-N-乙酰转移酶基因(AANAT)cDNA,酶切连接pTARGETTM载体,脂质体法导入L6成肌细胞。倒置显微镜观察转化细胞体外存活、RT-PCR及Western blotting技术检测pTARGETTM-AANAT的基因表达产物及转化细胞的功能表达。结果酶切分析、DNA测序及凝胶电泳检测结果证实,pTARGETTM-AANAT真核表达载体构建成功。RT-PCR及Western blotting检测表明,转化后的L6细胞表达AANAT mRNA,细胞具备AANAT蛋白的表达能力。结论成功构建pTARGETTM-AANAT的真核表达载体,转化的L6细胞株能表达AANAT蛋白活性。

褪黑素合成酶在绵羊胃中的表达

旨在了解绵羊各胃中褪黑素的合成情况。采取绵羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃等5个部位,用免疫组化、Western blot、RT-qPCR等方法,探讨褪黑素合成的关键酶AANAT和HIOMT在不同胃的定位和相对表达情况。结果表明,AANAT和HIOMT蛋白在绵羊各胃均有分布,且在各胃的黏膜层呈强阳性表达,其中在皱胃的表达量最高,AANAT在瘤胃背囊和瘤胃腹囊的表达量最低,而HIOMT在瘤胃背囊的表达量最低;AANAT和HIOMT mRNA水平均显示在网胃最高,其中AANAT在瘤胃背囊和瓣胃表达最低,而HIOMT在皱胃中表达最低。综上所述,在绵羊不同胃中均有AANAT和HIOMT的表达,并且AANAT和HIOMT存在表达差异,说明绵羊胃也具有自主合成褪黑素的功能,提示褪黑素可能通过自分泌和旁分泌的作用方式对绵羊胃功能活动进行调控,为进一步研究褪黑素对绵羊胃功能的调控作用机制提供了理论基础。

微囊对大鼠松果体细胞作用的实验研究

目的 探讨微囊化处理后大鼠松果体细胞 5羟色胺 N 乙酰转移酶 (NAT)mRNA的表达及细胞微囊的免疫原性 ,进一步明确人工松果体组织的功能活性与免疫屏蔽效能。 方法 海藻酸钠 聚赖氨酸 海藻酸钠生物微胶囊 (APA微囊 )包裹大鼠松果体细胞 ,采用RT PCR技术检测微囊与对照组松果体细胞的NATmRNA表达 ;运用3H标记胸腺嘧啶核苷 (3H TdR)掺入法比较微囊组、空囊组及游离松果体细胞的淋巴细胞转化值。 结果 不同培养时间对照组和微囊组松果体细胞的NATmRNA表达水平无显著差异 ;微囊组淋巴细胞转化值明显低于游离的松果体细胞 (P <0 0 1) ,但仍高于空囊组 (P <0 0 5 )。 结论 微囊包裹不影响松果体细胞NATmRNA的表达 ,表明APA微囊内松果体细胞代谢正常 ,分泌功能旺盛 ;松果体微囊有一定的免疫保护效应 ,但其隔离作用仍不完全。

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量PCR分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。

细叶远志皂甙对抑郁小鼠精神行为影响

目的探讨细叶远志皂甙(TEN)对抑郁小鼠精神行为的影响及机制。方法将72只SPF级昆明小鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组及TEN 3、6、9 mg/kg组,每组12只;采用慢性不可预知轻度应激加孤养28 d的方法复制小鼠抑郁症模型,灌胃给予不同剂量的TEN连续28 d,测试各组小鼠强迫游泳实验和悬尾实验的不动时间;行为学测试后取脑,检测脑皮质5羟色胺(5-HT)含量和吲哚胺2, 3–双加氧酶(IDO)活性及海马乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性。结果与对照组比较,模型组小鼠强迫游泳实验和悬尾实验不动时间[分别为(215.16±18.39)和(182.89±14.90)s]均明显延长(均P <0.01);与模型组比较,TEN 9 mg/kg组小鼠强迫游泳实验和悬尾实验不动时间[分别为(183.64±14.92)和(156.09±12.38)s]均明显缩短(均P <0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脑皮质内5-HT含量[(28.96±2.50)μg/L]明显下降、IDO活性[(11.87±1.11)ng/mg]明显增强(均P <0.01);与模型组比较,TEN 9 mg/kg组小鼠脑皮质内5-HT含量[(36.41±3.32)μg/L]明显升高、IDO活性[(7.24±0.71)ng/mg]明显减弱(均P <0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脑海马组织中AchE活性[(1.149±0.218)U/mg]明显增强、ChAT活性[(50.44±4.43)U/g]明显减弱(均P <0.01);与模型组比较,TEN 9 mg/kg组小鼠脑海马组织中AchE活性[(0.584±0.147)U/mg]明显减弱、ChAT活性[(86.05±3.94)U/g]明显增强(均P <0.05)。结论 TEN对抑郁小鼠精神行为有一定的改善作用,其机制可能与小鼠脑皮质内5-HT表达升高、IDO表达下降及海马组织中AchE活性下降、ChAT活性升高有关。