Ⅱ群禽腺病毒五邻体蛋白单因子血清的制备

通过PCR方法扩增得到Ⅱ群禽腺病毒火鸡出血性肠炎病毒(HEV)的五邻体(penton)基因,并构建了原核表达载体pET-32a-penton,将其转化至E.coil BL21中,通过诱导表达,以切胶回收的方式纯化蛋白,获得约70ku的重组融合蛋白,Western blotting检测纯化后的重组蛋白具有较好的抗原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了五邻体蛋白单因子血清,间接ELISA检测结果显示所制备的抗血清效价大于1∶40000。本试验获得的高效单因子血清,为Ⅱ群禽腺病毒特异性检测方法的研究奠定了基础。

非洲猪瘟病毒衣壳五邻体顶点蛋白(H240R)原核表达及免疫原性研究

【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。

血清4型禽腺病毒Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon)和五邻体蛋白(Penton)的串联蛋白及其多克隆抗体血清,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出Hexon基因和Penton基因,使用重叠PCR将Hexon基因和Penton基因串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到HP原核蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。SDS-PAGE分析显示,HP原核蛋白分子质量约为108 ku,Western Blot结果显示,HP原核蛋白可与His标签抗体和多克隆抗体血清特异性识别,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。

人腺病毒分子分型方法及其意义

人腺病毒(HAdV)是一种重要的病原体,其分子分型对于了解HAdV的生物学、流行病学和种属结构均至关重要。目前传统的血清学方法已确定了1~51种血清型,但该方法存在一定局限性。新型的基因分型方法主要根据五邻体蛋白、六邻体蛋白和纤维蛋白的序列分析确定了52~113型,其他新型HAdV的确定也主要依据基因组序列分析。因此,未来全面了解HAdV的分子分型方法及作用机制,可以为相关疾病的治疗提供新思路。

血清4型禽腺病毒hexon-penton串联蛋白在293T细胞中的表达

为了获得293T细胞表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体(hexon)和五邻体(penton)的串联蛋白,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出hexon基因和penton基因,其大小分别为1014,900 bp。使用重叠PCR将hexon基因和penton基因串联,得到hexon-penton(HP)串联基因。将HP基因导入表达质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-HP,转染293T细胞,获得HP真核蛋白。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定结果表明,HP真核蛋白可与多抗血清发生特异性反应,蛋白质相对分子质量约为90000,HP串联蛋白在293T细胞中获得了良好表达。研究结果表明成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HP,并在真核细胞中获得表达,为进一步研制FAdV-4核酸疫苗奠定基础。

昆明市一起聚集性发热疫情中腺病毒3型Penton base、Hexon和Fiber基因遗传进化分析

目的对昆明市一起聚集性发热疫情样本进行腺病毒检测和遗传进化分析。方法采集典型发热患者咽拭子标本,使用微流体芯片技术进行30种常见呼吸道传染病病原体核酸检测。对腺病毒核酸阳性标本使用Nanopore三代高通量测序技术进行Penton base、Hexon和Fiber三个重要基因全长序列扩增、测定和分型鉴定,构建系统进化树,开展分子变异、遗传进化等分析。结果共采集5份标本,均检出呼吸道腺病毒及流感嗜血杆菌。对腺病毒进行Nanopore三代基因测序最终均获得Penton base、Hexon和Fiber基因全长编码区核苷酸序列,5份标本之间3个基因核苷酸相似性依次为100.0%、99.9%~100.0%和100.0%,氨基酸同源性均为100.0%;与HAdV3原型株(AY599834)核苷酸相似性最高,分别为98.6%、98.7%和98.9%。系统发育分析表明,3个基因系统进化树分析结果基本一致,人腺病毒3型(HAdV3)原型株单独一支,本研究中HAdV3序列均划分在同一进化分支上,与较早年份国外及中国台湾毒株亲缘关系较远,与近年国内外毒株亲缘关系较近,与2019年日本株(LC703523)和中国广州株(MZ540961)高度同源。与原型株比较分析昆明HAdV3氨基酸突变位点,Penton base有5处变异;Hexon有10处变异;Fiber有11处变异。结论本起疫情中的腺病毒在Penton base、Hexon和Fiber基因全长序列中型别分型结果一致,为P3H3F3型,与包括原型株在内的国内外HAdV3毒株显示出非常小的遗传变异。与原型株相比发生了多处氨基酸位点突变,并且多数氨基酸位点变异发生在蛋白质的高变区或功能区,其中Hexon蛋白中M7L为昆明序列独有氨基酸突变位点。

基因测序在人类腺病毒分型中的应用

人类腺病毒可引起呼吸道、胃肠道和眼部的感染,不同类型的腺病毒引起的疾病类型及表现不尽相同.因此,腺病毒的分型具有重要的临床研究价值.在基因学上,编码六邻体蛋白,五邻体蛋白和纤维蛋白的区域是腺病毒基因组中变异最大的区域,通过对其编码区的测序,尤其是六邻体蛋白编码区的测序,是快速可靠的确定腺病毒类型的重要方法之一.此文主要对基因测序在腺病毒分型中的优势、应用现状,在腺病毒突变重组、种系发生学中的鉴定检测等作一综述.