嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA高活性启动子的克隆

将从嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA获得一段约1.4kb的DNA片段克隆进启动子探针载体pKK232-8,转化大肠杆菌HB101获得重组质粒PAS1(具有很强启动活性),可抗Cm达1000μg/mL。实验采用亚克隆技术,经过提取质粒、酶切、电泳、回收、连接等步骤将该有启动活性的插入片段缩小,欲获得一段有强的启动功能的最小活性片段。首先通过单酶切图谱发现该插入片段上有3个单酶切位点即kpnI、Bgl 和PstI;再将双酶切所得各DNA片段设计为不同的方案,或直接连接,或末端补平连接,或亚克隆处理,以启动子探针质粒pKK232-8为载体,转化大肠杆菌HB101,利用氯霉素平板筛选重组质粒。结果表明,该插入片段的活性功能存在于Kpn1和Hind 双酶切所得的一段约300bp的DNA片段,将该小片段进行亚克隆所得重组质粒PAS1-3仍有很强的Cm抗性。

KHI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响

目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97—H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况。结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致。免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度 integra oculus dehter,IOD20.127 ± 5.099 vs 12.675±1.921,P<0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675 ± 1.921,P<0.01).结论:成功构建了KAIl基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.

共聚焦定量分析WAF_1-S基因表达对人食管癌细胞系EC109生长的作用

目的:探讨抑癌基因WAF_1-S基因在食管癌细胞中的表达以及对食管癌细胞生长的抑制作用,为食管癌发病机制的研究提供一种新的思路,为食管癌基因治疗提供理论基础。 方法:采用亚克隆技术,将野生型WAF_1-S基因全长,通过双粘端克隆入真核表达载体pcDNA3中,用lipofectamine2000介导的方法转染EC109细胞(人食管癌细胞系)。通过打点杂交观察WAP_1-S基因mRNA在细胞中的表达,用Westem blot及激光共聚焦方法定量分析WAF_1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测EC109的生长状态,分析WAF_1基因对食管癌细胞株生长的影响。 结果:用内切酶酶切分析证实外源野生型WAF_1_S基因克隆入真核表达载体中,经打点杂交证实外源野生型WAF_1-S基因可以在EC109细胞中表达,通过激光共聚焦分析证实,转染后的食管癌细胞EC109中WAF_1-S的蛋白的表达明显高于对照组(32±15 vs 11±7,P<0.05),对细胞进行周期分析表明,处于G_0～G_1期细胞为0.47～0.65。 结论:通过转染外源野生型WAF_1基因可提高WAF_1基因表达,增加食管癌细胞中P^(21)蛋白的表达量,从而提高WAF_1基因表达,抑制细胞的生长。

巨噬细胞移动抑制因子活性抑制肽的筛选和鉴定

目的:巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitoryfactor,MIF)参与了多种病理生理过程,如多种类型的感染以及关节炎、肾小球肾炎等自身免疫疾病以及动脉粥样硬化的发生、形成过程.本文将利用酵母双杂交技术从预制随机肽库中筛选能有效抑制MIF活性的多肽,为研制MIF活性抑制剂提供候选分子.

双位点核酶抑制细胞内HBV表达的图像分析

目的：利用ＬＥＩＣＡＱ５００ＭＣ图像分析系统观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对细胞质中Ｃ区基因表达的抑制作用。方法：采用亚克隆技术，从ｐＧＥＭＲｚ１２３（含针对ＨＢＶＣ区双位点核酶）上切下双位点核酶的片段，定向克隆于真核表达载体ｐＢＢＳ２１２中，利用Ｌｉｐｏｆｅｃ－ｔａｍｉｎｅ介导，将重组质粒ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ转染入２２１５细胞中，采用原位杂交观察核酶的表达，采用免疫组化、图像分析法分析ＨＢｃＡｇ的表达。结果：筛选２周后，原位杂交证实可表达针对ＨＢＶＣ区双位点核酶。免疫组化及图像分析证实该核酶可抑制Ｃ区基因表达。结论：应用图像分析法可定量地观察到核酶对Ｃ区基因表达有阻断作用，抑制ＨＢｃＡｇ的合成。