一株溶藻菌 Zobellella sp. B307对太平洋亚历山大藻的溶藻特性及作用机制研究

为研究溶藻菌对赤潮甲藻的作用机制,本文从胶州湾沉积物中分离得到的一株耐盐菌株Zobellella sp.B307,并研究了该菌株对太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)的抑制效果,从细胞结构、生理水平和分子水平探究了该菌株的抑藻途径及作用机制。结果表明,该菌株的抑藻途径为分泌胞外活性物质的间接溶藻,72 h的溶藻率高达91%。溶藻过程中藻细胞壁破损,叶绿素a和总蛋白含量显著下降,藻细胞的活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于对照组,这表明溶藻物质对藻细胞造成的强烈氧化损伤是导致其死亡的直接原因。热休克蛋白基因(HSP)表达量显著上调,说明溶藻物质激发藻细胞产生的ROS在激活抗氧化系统的同时诱导产生HSP70,二者联合清除ROS以减缓藻细胞受应激损伤的程度;A.pacificum的网格蛋白基因(Clathrin)表达量显著上调,表示由网格蛋白介导的胞吞作用明显增强,进而说明为减轻光合营养功能受损造成的影响,藻细胞的异养功能增强。本研究结果有助于诠释菌藻关系,更为探究赤潮治理的生物方法提供重要的理论支持和实践指导。

链状亚历山大藻暴露下紫贻贝体内麻痹性贝毒蓄积转化规律

本研究将紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)暴露于一株麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)优势产毒藻——链状亚历山大藻(Alexandrium catenella, GY-H25株),模拟现场赤潮藻密度,探究了紫贻贝内脏团和可食组织中蓄积代谢及生物转化过程,并通过蓄积代谢动力学,重点比较了不同细胞密度GY-H25对紫贻贝体内毒素蓄积代谢和转化情况的影响。结果显示,GY-H25生长及产毒稳定,PSTs组分主要为N-磺酰胺甲酰基类毒素(C1和C2),单细胞最高产毒能力为2.96 pg STXeq/cell。暴露实验中,紫贻贝对PSTs有较强的蓄积作用,2种暴露浓度下PSTs含量变化趋势一致,实验结束时,2种暴露组紫贻贝内脏团中PSTs均超过欧盟国际限量标准(800μg STXeq/kg),但可食组织则均低于限量标准;比较发现,高浓度组紫贻贝内脏团最高蓄积浓度达到6 815.36μg STXeq/kg,且高浓度组暴露期间平均蓄积速率为17.89%,显著高于低浓度组13.06%的蓄积速率。另外,紫贻贝对PSTs表现出较强的生物转化能力,在对C1、C2和GTX5三者的转化研究中发现,快速代谢时期和平稳期C2→GTX5的转化为GTX5生成的主要途径,同时期C1的相关转化中C1→GTX5途径超过C2→C1,致使C1整体占比减少。综合评估紫贻贝中PSTs转化产物和毒性当量因子(toxic equivalency factor, TEF),发现紫贻贝对PSTs代谢转化进一步促使高毒性GTX5的生成和占比提升,总体终端毒性升高,这也可能是秦皇岛紫贻贝中PSTs风险严峻的主要原因之一。因此,本研究有助于科学评估紫贻贝中PSTs风险,为建立区域性风险监测技术提供科学基础。

氮限制条件下链状亚历山大藻H3K4me3的调控机制解析

为探索链状亚历山大藻(Alexandrium pacificam)在低氮条件下的适应性反应机制,本研究采用结合位点分析法(ChIP-seq)比较了链状亚历山大藻氮限制和氮正常条件下组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)修饰情况及调控机制,GO分析结果表明H3K4me3修饰在低氮条件下调控了跨膜转运蛋白活性,表明在低氮条件下链状亚历山大藻增强了转运体活性来获取外界营养物质。通过KEGG分析发现还富集了植物病原菌相互作用途径和谷胱甘肽代谢途径,表明链状亚历山大藻在低氮条件下,病原菌防御和抗氧化应激对其生存至关重要。此外还发现在低氮条件下H3K4me3调控了泛素介导的蛋白质降解和自噬途径来缓解氮的耗竭而响应氮胁迫。

太平洋亚历山大藻对凡纳滨对虾的急性毒性效应

【目的】研究太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的存活率、抗氧化能力以及组织结构的影响。【方法】采用浸浴法,将凡纳滨对虾暴露于太平洋亚历山大藻破碎液中72 h,检测肝胰腺中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽—S转移酶(GST)、碱性磷酸酶(AKP)、多酚氧化酶(PPO)等抗氧化酶的活力。对有毒藻浸浴处理和正常海水中对虾的肠道、肝胰腺、鳃、肌肉和神经组织的HE染色石蜡切片进行观察。【结果】太平洋亚历山大藻浸浴处理对凡纳滨对虾的存活率有显著影响(P<0.01)。与对照组相比,太平洋亚历山大藻会诱导对虾肝胰腺的MDA含量增加,导致肝胰腺发生脂质过氧化;同时,诱导GST、GSH、SOD、AKP和PPO的活力增强以清除多余氧自由基,抑制脂质过氧化作用。活性氧(ROS)过多会导致对虾氧化-抗氧化系统的平衡受损,72 h时,实验组对虾肝胰腺的GSH含量显著低于对照组(P<0.01),SOD、GST以及AKP活力也显著低于对照组(P<0.01)。石蜡切片观察发现,太平洋亚历山大藻引起了对虾肠道、肝胰腺、鳃、肌肉和神经组织细胞肿胀、空泡化等病理变化。【结论】急性暴露于太平洋亚历山大藻会引起对虾重要组织和器官病变,诱导对虾肝胰脏抗氧化酶的改变,这将有助于解释甲壳类动物在太平洋亚历山大藻胁迫下存在的解毒机制。

磷浓度对2种有毒亚历山大藻生长和产毒力的影响

采用显微镜细胞计数和标准藻毒监测方法—小鼠生物法,研究了0、1.8、3.6和5.4μmol/L4种磷浓度对有毒甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和微小亚历山大藻(Alexandtium minutum)的生长和产毒力的影响。结果表明,磷浓度对2种甲藻的生长和产毒能力均有显著性影响(P<0.05)。塔玛亚历山大藻在3.6μmol/L磷浓度组的密度显著高于其他3个磷浓度组(P<0.05),在0μmol/L磷浓度组的密度显著低于其他3个磷浓度组;微小亚力山大藻在1.8、3.6和5.4μmol/L磷浓度下生长无显著性差异(P>0.05),但在0μmol/L磷浓度下生长缓慢,藻密度显著低于其他3个磷浓度组(P<0.05)。塔玛亚历山大藻和微小亚历山大藻均在0μmol/L磷浓度下产毒能力最高,分别为3.0×10-4和5.2×10-4MU/个,显著高于其他磷浓度组(P<0.05),塔玛亚历山大藻在3.6μmol/L磷浓度下产毒能力最低,为0.1×10-4MU/个,显著低于其他组(P<0.05),其他磷浓度组之间无显著性差异(P>0.05)。

不同温度对微小亚历山大藻生长和藻毒力的影响

水体中的藻类是麻痹性贝毒的主要来源，现已知海洋中有13种单细胞的甲藻类可产生麻痹性贝毒。目前在我国海区已经发现的产毒甲藻主要有3种：塔玛亚历山大藻（Akexandrium tamarense）、微小亚历山大藻（Alezandrium minudum）、链状亚历山大藻（Alexandrium acatenella）。微小亚历山大藻在我国台湾沿海较常见。因此，有必要针对我国沿海的微小亚历山大藻生理生态进行研究，以完善有毒赤潮、藻毒素监测与防治，保障我国海水养殖业的持续发展和消费者健康。

塔玛亚历山大藻对氮和磷的吸收及其生长特性

参照塔玛亚历山大藻 (Alexandriumtamarense)赤潮爆发时的物理条件 ,以f/ 2加富的人工海水为培养基 ,设定了不同的氮、磷水平 ,研究了在室内批量培养条件下 ,塔玛亚历山大藻对无机氮、磷的吸收和无机氮、磷对塔玛亚历山大藻细胞生长的影响 .结果表明 ,3种氮浓度条件下 ,塔玛亚历山大藻的比生长速率几乎没有差异 ,但低氮 (0 .0 882mmol·L-1)条件下 ,藻细胞的生物量最低 ;中氮 (0 .882mmol·L-1)条件下 ,藻细胞具有最大的生物量 ,分别比高氮 (2 .6 4 6mmol·L-1)和低氮下增加 4 4 .7%和 5 3.6 % .随着培养基中磷浓度的升高 ,藻细胞生物量也升高 ,在高磷 (0 .10 8mmol·L-1)条件下达到最大值 172 0 0cell·ml-1,但在中磷 (0 .0 36mmol·L-1)条件下藻细胞具有最大的比生长速率 .藻细胞对氮、磷的吸收速率与生长状态有密切关系 ,氮、磷限制条件下生长的藻细胞对氮、磷有快速的吸收 .研究显示 ,低的N/P比有利于塔玛亚历山大藻的生长分裂 ,对数生长后期适当补氮则有利于其生物量的积累 .

塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾存活、生长以及种群繁殖的影响

通过塔玛亚历山大藻 ( Alexandrium tamarense)对黑褐新糠虾 ( N eomysis awatschensis)的急性和慢性毒性作用研究 ,发现塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾的存活、生殖、生长等有不利影响 ,影响程度随塔玛亚历山大藻藻细胞密度的增加而增加。在 96 h急性毒性实验中 ,塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾的半致死密度为 70 0 0 cells/ml,去藻过滤液中糠虾的死亡率为 2 5 %。在 6 2 d的慢性毒性实验中 ,密度为 90 0 cells/ml的塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾的繁殖有严重影响 ,在此影响下的实验组亲虾产幼虾总数只有 2 7尾 ,仅为对照组产幼虾数目的 1 6 .4 % ;其总产幼虾天数、日最高产幼数分别只有对照的 32 %、4 1 % ,其初次产虾日期也推迟了 3d,并出现了 3次生殖中断。塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾亲虾的存活、生长也有一定的影响 ,处在密度为 90 0 cells/ml塔玛亚历山大藻中的黑褐新糠虾亲虾的存活率只有对照的 6 3% ,糠虾亲虾的体长和体重分别为对照组亲虾的 95 .6 %和 81 .9% ,但差异尚不显著 ( P>0 .0 5 )

温度、光照和pH值对锥状斯氏藻和塔玛亚历山大藻光合作用的影响及光暗周期对其生长速率和生物量的影响

用测定净光合放氧速率的方法研究了温度、光照和pH对锥状斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)和塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)光合作用的影响。在不同光暗周期(L:D)条件下培养锥状斯氏藻和塔玛亚历山大藻,研究了光暗周期对生长繁殖速率和生物量的影响。2种藻对温度的变化敏感,适宜的温度范围是17～25℃,最适温度20～22℃,低于10℃和高于30℃不能生长;锥状斯氏藻的光饱和点是400μmol·m-2·s-1,塔玛亚历山大藻的光饱和点是650μmol·m-2·s-1,都属于喜高光强的微藻;2种藻对pH值的变化极其敏感,适宜的pH值范围很小,为7.0～9.0,最适pH值7.5～8.0,与其生活的海洋环境一致,pH值高于9.5时,不能进行有效的光合作用,pH值10.0可致全部细胞死亡;在一定范围内,2种藻的生长速率(μ)和生物量随着光照时间的延长呈比例增加。

我国东南沿海亚历山大藻休眠孢囊的分布和萌发研究

对 4个海域的塔玛亚历山大藻 (Alexandriumtamarense)和链状亚历山大藻 (A .catenella)休眠孢囊的分布及萌发进行了研究 .结果表明 ,厦门港仅在X1和X2站位有分布 ,且密度很小 (0 .4个·g-1) ;广西只在G2站位有发现 ,密度较少 (2 .5个·g-1泥样 ) .闽江口有 3个站位有分布 ,M4站位的 4～ 6cm层密度最大 ,达到 6个·g-1泥样 ;长江口的孢囊分布广、密度大 ,DG 2 6站位的 8～ 10cm层孢囊密度达到了 2 3.2个·g-1泥样 .孢囊的分布与沉积物底质类型、沉积速率、海流都有一定的关系 .光照对孢囊萌发没有影响 ,温度升高导致萌发率和存活率均增大 ,而萌发时间缩短 ;在低氧条件下 (0 .0 1mgO2 L-1) ,孢囊萌发率为 0 .亚历山大藻孢囊在合适的环境条件下终年都会萌发 .

不同类型含磷营养物质对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)生长和毒素产生的影响

采用显微镜细胞计数和麻痹性贝毒的高效液相色谱分析方法,通过对比磷酸二氢钾、磷酸甘油和三磷酸腺苷(ATP)等含磷营养物质对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响,研究了微小亚历山大藻对不同类型含磷营养物质的利用情况。结果表明,在磷限制条件下,加入磷酸二氢钾、磷酸甘油和ATP均能促进微小亚历山大藻的生长,所获得的最大藻细胞密度分别为22700、28400和27800藻细胞/ml,对数期生长速率分别为0.12/d、0.14/d和0.15/d,溶解态有机磷对藻生长的促进作用稍好于溶解态无机磷。三种含磷营养物质对毒素产生的效应没有明显差别,稳定期藻细胞毒素含量分别为22.87、23.98和21.80fmol/cell。磷限制对毒素组成的影响很大,磷限制条件下膝沟藻毒素GTX1/4的含量占绝对优势,GTX2/3含量很少。在添加含磷营养物质后,GTX1/4所占比例降低,GTX2/3比例增加,说明磷限制显著改变了微小亚历山大藻的毒素组成。对藻体碱性磷酸酶活性分析的结果显示,磷限制组具有最高的碱性磷酸酶活性,添加有机磷化合物实验组的碱性磷酸酶活性显著高于添加无机磷化合物的实验组。研究结果表明,微小亚历山大藻可以利用实验中采用的无机磷化合物和有机磷化合物,但其利用溶解态有机磷化合物的机制尚不清楚,可能是通过诱导合成碱性磷酸酶来水解培养基中的溶解态含磷有机物,从而释放无机磷酸盐用于藻细胞的生长。

不同氮源对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响

通过尿素、氯化铵、酵母浸出粉和硝酸钠等氮源对微小亚历山大藻（Alexandrium minutum）生长及毒素产生的影响研究，分析了微小亚历山大藻对不同氮源利用状况的差异．结果表明，在氮饥饿条件下，加入硝酸钠和酵母浸出粉能显著促进微小亚历山大藻的生长；高浓度的氯化铵在加入后对微小亚历山大藻有一定的毒性效应，表现为生长停滞，但毒性效应在5d后消失，并得到与添加硝酸钠及酵母浸出粉相似的增长速率0．21d^-1；添加尿素对微小亚历山大藻的生长没有显著促进作用．在四种氮源中，尿素对微小亚历山大藻毒素产生的刺激作用也最弱，在稳定期每个细胞藻细胞毒素含量维持在6．00～8．00fmol；添加硝酸钠、氯化铵和酵母浸出粉的藻细胞在稳定期毒素含量分别达到11．85，12．86和14．64fmol．硝酸钠和氯化铵刺激藻毒素产生的效果比酵母浸出粉更为直接．四种含氮营养盐对微小亚历山大藻毒素组成的影响都很小．

单种及混合培养条件下Fe、Mn对赤潮生物塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)生长的影响

研究了单种和两种混合批量培养条件下 ,Fe EDTA(Fe3+)、Mn(Mn2 +)浓度对甲藻塔玛亚历山大藻 (Alexandriumtamarense)生长及细胞大小的影响 ,同时考察了与其混合培养中的中肋骨条藻 (Skeletonemacostatum)和圆筛藻 (Coscinodis cussp .)的生长特性 .结果表明 :在本实验的浓度范围内 (Fe EDTA ,0— 3 1 5μg/L ;Mn2 +,0— 0 1 8μg/L) ,铁、锰浓度的升高对单独培养条件下的 3种藻类的生长均有不同程度的促进作用 ,揭示了微量元素铁、锰是触发赤潮发生的重要因子之一 ;在混合培养条件下 (甲藻 硅藻 ) ,细胞较小的中肋骨条藻和圆筛藻在竞争中处于优势地位 ,塔玛亚历山大藻在一定时间的混合培养后衰败 .不同铁、锰浓度及不同培养条件对塔玛亚历山大藻细胞大小有显著影响 .

有机氮对大亚湾亚历山大藻种群生长的促进作用

2008年1-12月对大亚湾澳头养殖海域溶解有机氮（DON）组成、含量与亚历山大藻种群动态进行了周年调查，同步监测了无机营养盐、水温、盐度等主要环境因子,结果显示，大亚湾澳头海域DON水平4-6月较高。最大值达21．27umoIN／L，其余月份较低，全年平均浓度为7.44umoIN／L．尿素是DON的重要组分，全竽平均浓度为1．98unoIN／L，约占DON的20％-30％．可溶性游离氨基酸（DFAA）波动较大，介于1-5tunolN／L．4-6月亚历山大藻种群维持较高密度,4月21日澳头海域发生亚历山大藻水华，最高细胞密度达到3319ceUs／mL．DON和尿素浓度高峰与亚历山大藻密度高峰同步出现，水华消散后DON和尿素浓度分别大幅下降至高峰期的23．84％和62.86％．统计结果显示，表征有机污染程度的DON、尿素和CODMn与亚历山大藻种群密度具有显著正相关关系（p〈O．05）．DON含量的增加能够促进亚历山大藻的生长，并在温度、盐度等环境条件适宜的情况下可能成为赤潮暴发的重要诱因。

环境因子对塔玛亚历山大藻生长的综合影响

利用多因子实验设计,研究了主要环境因子温度、盐度和光照强度对麻痹性贝毒产毒藻——塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）生长的影响.经三维ANOVA统计分析（Tukey test）结果表明,在实验条件范围内（温度12,19,25,32℃;盐度10,18,25,30,35和光照强度0.02×10^（16）,0.08×10^（16）,0.3×10^（16）,1.6×10^（16）s^（-1）/cm^（2））,温度、光照强度和盐度对藻生长率有显著的影响（P<0.001）.光照强度和温度、盐度和温度、光照强度和盐度以及这3个因子之间存在显著的相互作用（P<0.001）,在本实验中该藻生长的最适条件是19℃,1.6×10^（16）s^（-1）/cm^（2）,盐度30.根据塔玛亚历山大藻的生长特性,我们探讨了这些环境因子在塔玛亚历山大藻赤潮形成机制中的作用.

塔玛亚历山大藻藻际细菌溶藻过程

海洋微藻在生长过程中向周围环境分泌多种胞外产物,形成细菌自由生长的藻际环境,藻际细菌对微藻的生长有一定的调控作用。在指数生长期的塔玛亚历山大藻培养液中加入φ为1%的2216E培养基,在加入2216E后16h内藻细胞全部裂解。用数码显微镜记录了藻细胞形态变化,分别用DAPI法和荧光模拟底物法测定了细菌数量、胞外酶活性变化,结果表明:在溶藻过程中细菌数量、胞外酶活性在第6小时到第10小时增加了50～100倍。塔玛亚历山大藻藻际细菌主要分布在藻细胞表面,其群落结构改变和数量剧增是溶藻的主要原因,细菌分泌的β-葡萄糖苷酶和几丁质酶可能在溶藻过程中起重要作用。

8种抗生素对塔玛亚历山大藻生长的影响

对一株有毒的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense (Lebour) Balech)进行了8种抗生素—氯霉素、红霉素、林可霉素、庆大霉素、金霉素、氨苄青霉素、新霉素和链霉素的敏感性实验.结果表明,该藻对抗生素较为敏感.其中的5种:氯霉素、红霉素、林可霉素、庆大霉素和金霉素,对藻8 d比生长速率的EC50分别为2.45μg/cm3,25.2μg/cm3,7.95μg/cm3,285 u/cm3,58.7μg/cm3,可用作该藻基因工程的选择压力,其对应的抗性基因可以作为基因工程阳性选择标记基因,应用于塔玛亚历山大藻的遗传操作研究.新霉素和链霉素对A.tamarense的生长无明显抑制作用,可以用于藻株无菌化培养而应用于甲藻产毒机制和赤潮爆发机理的研究,还应用筛选出的抗生素对藻培养物进行了除菌实验.

塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻对黑褐新糠虾和卤虫的急性毒性作用

以黑褐新糠虾和卤虫为实验材料,研究了两种典型有毒有害赤潮藻,塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻的毒性.结果表明塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻都能影响糠虾的存活,在96h内塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻对糠虾的半致死浓度分别约为7000和450000个/cm3;在24h内塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻对卤虫存活没有显著影响,而赤潮异弯藻能对卤虫的活力产生强烈的抑制作用,0 1,1 5,5和24h的半抑制浓度分别为15000,7500,4500,3000个/cm3,但在赤潮异弯藻较低浓度为3000个/cm3时,经过48h卤虫的运动能力能够恢复到正常水平.结果表明,这两种有害藻对同一种生物的毒性大小存在差异,而这两种甲壳类生物对同一种有害藻的反应也不相同.

南海有毒塔玛亚历山大藻的分子地理标记分析

采用聚合酶键扩增反应（PCR）和限制性片段长度多态性分析（RFLP）方法，对1992年5月和1994年间月采自中国南海大鹏湾、大亚湾、香港海域的赤潮有毒甲藻塔玛亚历山大藻8个不同地理株的核糖体小亚基RNA基因（Ss－rDNA）进行分析，并与北美、西欧等地的比较。结果表明，中国南海的塔玛亚历山大藻缺少B基因，这与北美等地的塔玛亚历山大藻（包括有毒和无毒株）不同，而与西欧、澳洲等地的有毒和无毒株相似，提示B基因的存在可以作为一种分子地理标记而不是藻种有毒的标记。

中国沿海亚历山大藻(Alexandrium)核糖体rDNA部分序列分析及该藻属分子系统进化研究

分析了几株自南海及东海分离的亚历山大藻的rDNA部分序列信息,其中包括核糖体大亚基(LSU)rDNA的5′端D1-D2区序列,以及5.8SrDNA和ITS区序列;同时也对实验室保种的部分来自其它国家和地区的亚历山大藻相关序列进行了测序和分析,并以此作为序列分析中的参考。采用ClustalX及MEGA2软件对所得到的序列信息进行了综合分析与对比。结果表明,分离自南海的塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)和分离自东海的链状亚历山大藻(A.catenella),即便是在ITS区和LSUrDNA等高变区,其序列信息也完全一致。与基因库中搜索到的其它亚历山大藻rDNA序列信息相比较,中国沿海的塔玛/链状亚历山大藻序列更接近于塔玛复合种的“亚洲温带”基因型。对于分离自南海的另外两株未定种的亚历山大藻,通过对比序列信息,发现它们与相关亚历山大藻(A.affine)非常接近。分离于我国台湾地区的微小亚历山大藻(A.minutum)在序列上与分离自新西兰的藻株相似,而与分离自欧洲的微小亚历山大藻藻株相差较大。中国沿海亚历山大藻rDNA序列信息的获得为针对有毒藻种设计特异性核酸探针,发展灵敏快速的生物检测技术奠定了基础。