海洋亚历山大藻属分子系统学研究进展

亚历山大藻属Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ是一类重要的赤潮甲藻，由于传统的分类鉴定往往标准不一，因而容易引起分类上的混乱．近年来，人们已逐渐转向分子分类、分子系统及分子毒理方面的研究，试图从分子水平认识亚历山大藻的遗传特征，以便获得稳定、可靠的分子指标．本文对这一最新研究进展作了综合分析。

海洋亚历山大藻属种间界定的分子标准

通过计算机联网从Ｇｅｎｂａｎｋ中及实验分析获取亚历山大藻属Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ共５种１２个株系的ｒＤＮＡＩＴＳ序列，并采用计算机分析软件包对其进行分析及构建树图结果表明，亚历山大藻属不同种，种间序列有显著差异（核苷酸差异大于０２０），而种内个体间ＩＴＳ区序列则非常相似（仅００１差异），表明了ＩＴＳ区用于该属的分类鉴定是一个较稳定的指标．根据序列比较结果，得出：①形态非常相似的Ａｃａｔｅｎｅｌａ，Ａｔａｍａｒｅｎｓｅ有毒种类，分子水平有明显差异，不同意将这两个种称为“ｔａｍａｒｅｎｓｅｃｏｍｐｌｅｘ”；②根据种间序列核苷酸的差异系数，提出了该属种间界定的分子标准，同时对形态学鉴定的某些株系，如ＡｔａｍａｒｅｎｓｅＣＵ１５等提出了异议．可以看出，ＩＴＳ区的研究从一个新的角度为海洋微藻种的界定提供了很好的依据．

亚历山大藻溶血毒性的初步研究

研究了11株亚历山大藻(Alexandrium spp.)的溶血毒性,其中7株亚历山大藻具有显著的溶血毒性,说明溶血毒性在亚历山大藻中具有一定的普遍性,但各亚历山大藻藻株溶血毒性的大小与其所产麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)的能力无直接关系;针对性地研究了一株典型PSP产毒甲藻---塔玛亚历山大藻(A.tamarense,ATHK株)的溶血毒性特点,该株亚历山大藻具有较强的溶血毒性,指数期单个藻细胞的溶血毒性大小约相当于4pg皂素的溶血能力,而且其溶血毒性的大小与藻的生长阶段和细胞密度都有一定关系:指数期的溶血毒性最大;藻细胞、细胞碎片、细胞内容物都有一定的溶血毒性,其中细胞碎片的毒性最大;研究还表明一种PSP标准品STX毒素并没有溶血毒性,进一步说明亚历山大藻产生的溶血毒性是其他非PSP物质造成的,这类溶血毒素对人类健康和生态环境的影响值得关注。

塔玛亚历山大藻对卤虫干重及能值的影响

研究了有毒赤潮藻塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense对甲壳动物卤虫的干重及能值的影响。实验表明,经过18h的染毒实验,7 500尾卤虫Artemia parthenogenetica在水体中有塔玛亚历山大藻细胞或过滤液(细胞密度均为200cells.ml-1)存在的情况下,其总干重及总能值的增加明显受到抑制。卤虫总干重,对照组增加0.010 4g,而滤液组和藻细胞组均增加了0.002 2g,仅为对照组的21.1%;卤虫总能值,对照组增加0.143 5kJ,而滤液组和藻细胞组则分别增加0.018 0kJ和0.056 8kJ,分别为对照组的39.5%和12.5%。经SAS软件分析,塔玛亚历山大藻细胞对卤虫总干重的影响与对照组比较有显著性差异(p=0.037 0),而对其总能值增加则无显著差异(p=0.1251);而塔玛亚历山大藻过滤液对卤虫的总干重、总能值的增加与对照组都有显著性差异(p分别为0.021 5和0.013 5)。另外,无论是藻细胞或是过滤液对卤虫的比能值均无影响。有毒塔玛亚历山大藻使卤虫总干重减少可影响其他相关海洋动物的食物供给,而对卤虫能值的影响则表明毒藻可改变食物链中能量的传递效率,从而影响处于较高营养层的生物。研究还显示该藻的不利影响可出现在赤潮发生期及消退期,这为全面了解赤潮危害提供新的视角。

一株赤潮甲藻转录单元内间隔区(ITS)和5.8S rDNA序列的克隆

为解决分子生物学方法中因纯化的新鲜材料不足而限制实验进展的情况,采用改进的克隆方法将目的DNA片断保存在菌株中。首先应用改进的DNA提取方法从赤潮甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)中提取总核酸,以提取的DNA为模板,优化PCR扩增条件,获得转录单元内间隔区(ITS)片段。将获得的ITS片段经SalI和PstI双酶切后与同样经过双酶切后的质粒载体pBluscriptSK+连接,转化受体菌XL1-Blue,克隆该DNA片段。该克隆方法简单易行,克隆效率完全可以满足一般实验要求。该克隆技术的应用为随时获得目的DNA提供一条途径。

孔石莼与2种海洋微藻的胞外滤液交叉培养研究

在实验室条件下,采用海洋大型海藻石莼(Ulva pertusaKjellm.)和海洋微藻青岛大扁藻(Platymonas helgolandicaKylin var.tsingtaoensis)、亚历山大藻(Alexandrium tamarense(Lebour)Balech)的滤液做了交叉培养研究,初步探索藻间的克生机制。试验结果表明,不同温度处理下,2种微藻滤液对石莼生长的影响均有显著的差异。不同温度处理的石莼滤液对青岛大扁藻生长的影响差异显著,而对亚历山大藻生长的影响差异不显著。可以推测:石莼对亚历山大藻的抑制作用很可能是通过细胞的直接接触来完成的;而石莼对青岛大扁藻的抑制作用和两种微藻对石莼的抑制作用主要是通过分泌胞外产物(Extracellular products,ECP)来实现的,至于其它的方式和途径有待于进一步研究。

3种赤潮微藻对UV-B辐射处理的敏感性

通过实验生态学的方法,研究了赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)、亚历山大藻(Alexandriumtamarense)和中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)的生长对UV-B辐射增强的响应。结果表明,UV-B辐射处理对赤潮异弯藻的生长始终表现出抑制效应,而低剂量的UV-B辐射处理对亚历山大藻和中肋骨条藻的生长有刺激作用,高剂量的UV-B辐射处理对亚历山大藻和中肋骨条藻的生长仍然显示出抑制作用。UV-B辐射对赤潮异弯藻、亚历山大藻和中肋骨条藻的96h半抑制剂量分别为1.63、2.34和2.58J/m2。

2005—2006年大亚湾大鹏澳养殖区甲藻孢囊通量的沉积捕捉器研究

于2005年3月至2006年4月在大亚湾的大鹏澳养殖区采用沉积物捕捉器,对甲藻孢囊形成和水温、盐度、营养盐含量等环境因子进行了周年调查,探索该区孢囊形成特征及其与环境因子的关系。在一年的沉积物捕捉器研究中,共分析鉴定出27种甲藻孢囊类型,锥状斯氏藻Scrippsiella trochoidea孢囊为该区最优势孢囊类群,从孢囊的组成显示了该区的污染是以养殖和生活污染为主。孢囊形成没有明显的季节分布特征,两个站年平均为1.07×105cysts.(m2.d)?1。高、低温都能在一定程度上促进孢囊的生成,氮限制对孢囊的形成具有明显促进作用。首次发现亚历山大藻Alexandrium孢囊在冬季形成的高峰,最高值达4.26×105cysts.(m2.d)?1。这说明核电站温排水冬季高水温对大亚湾生态环境有较大的影响。

一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法

报道了一种快速制备PCR扩增甲藻细胞模板DNA的方法。以赤潮甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)和链状亚历山大藻(A.catenella)为目标藻,对藻液预处理后直接用于PCR扩增,获得5.8S核糖体RNA基因及其两侧的核糖体RNA基因转录单元内基因间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)序列片段,成功测序。此方法避免了复杂的DNA提取过程。

用于单一藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense ATHK藻株)作为实验对象,分别选择了5%福尔马林固定后常温保存、95%乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液(Lugols solution)固定后常温保存等方法,在5,15,30,60 d后对保存的样品进行单细胞PCR反应,并与新鲜样品进行比较。实验结果表明,用95%乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60 d后仍可扩增出目标条带,与新鲜样品没有差别,但是样品中的藻细胞形态有一些改变;而以5%福尔马林固定保存的样品只能在5 d后扩增出目标条带,但藻细胞形态比较完好。因此,对用于单细胞PCR实验的微藻样品,短期内(不多于5 d)可以采用福尔马林保存,而需要长期保存的样品,应当采用乙醇或鲁哥氏液固定,或者采用-20℃冷冻保存的方法。

麻痹性贝毒在文蛤体内的累积及净化技术研究

试验研究分毒素累积和解毒两个阶段,文蛤(Meretrix meretrix)对麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)的累积能力试验中每天投喂一定量塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),定期测定文蛤体内的毒素含量;解毒试验通过投喂饵料和水体消毒的"内排外解"法进行。结果表明:文蛤对麻痹性贝毒的累积能力较弱,累积试验末期(15 d)的内脏毒素累积量仅为884μg/100g,内脏中毒素累积量高于肌肉,占全贝的77.4%～89.1%。15 d的解毒试验中,三组文蛤体内的毒素含量都有下降,对照组毒素排出量占总累积量的30.1%,臭氧处理组占32.8%,"内排外解"法处理组毒素排出比例最高,达总累积毒素的47.2%。试验表明,"内排外解"法能加快文蛤体内PSP的排出。