亚低温对大鼠短暂性全脑缺血后皮质NOS亚型表达及神经元凋亡的影响

目的观察亚低温对大鼠全脑缺血再灌注后皮质3种一氧化氮合酶亚型表达、一氧化氮产生以及神经元凋亡的影响,探讨亚低温的神经保护机制。方法成年雄性SD大鼠,采用双侧颈总动脉阻断闭塞+低血压法制备短暂性全脑缺血动物模型,随机分为常温缺血组、亚低温缺血组和常温假手术对照组;常温时的脑温为36.5℃～37.5℃,肛温为35.9℃～36.9℃;亚低温时控制在32.5℃～33.5℃,相对应肛温为32.2℃～33.1℃;分别于缺血后及亚低温治疗后30min、2h、24h和72h观察短暂缺血对脑组织一氧化氮合酶亚型表达及神经元凋亡的影响,以及亚低温对缺血性脑损伤的保护作用。行神经元尼氏体亚甲蓝染色观察神经元数目及形态学的变化;免疫组化染色检测神经元型、诱导型和内皮型一氧化氮合酶的表达水平;应用硝酸还原酶法检测硝酸盐/亚硝酸盐水平的变化;采用TUNEL染色法并结合电子显微镜观察神经元凋亡的变化。结果常温缺血组大鼠额叶皮质3种一氧化氮合酶亚型表达水平及硝酸盐/亚硝酸盐含量均明显高于常温假手术对照组(P<0.05或P<0.01),出现凋亡神经元;低温缺血组大鼠3种一氧化氮合酶亚型表达水平和硝酸盐/亚硝酸盐含量明显低于常温缺血组(P<0.05或P<0.01),未检测到凋亡神经元。结论脑缺血后一氧化氮参与了神经元的凋亡过程。

结肠癌与正常结肠组织IGF-1基因亚型表达差异性研究

结肠癌以40~50岁人群为主要发病对象，其发病率在所有恶性肿瘤中占10%~15%[1]。由于结肠癌早期症状无特异性，临床诊治时往往为中晚期，死亡率较高。因此了解结肠癌发生、发展特点及危险因素对预防结肠癌具有十分重要的意义[2]。近年来相关研究发现，IGF-1（胰岛素样生长因子1）、Ki-67表达与结肠癌发病存在一定的关联，其中IGF-1及其亚型表达可能参与结肠癌细胞增殖及迁移，且其表达与肿瘤风险相关；Ki-67在肿瘤良恶性、恶性程度判断中有重要作用，且被作为相关临床因素及患者预后的重要指标[3]。为此我们通过分析结肠癌与正常结肠组织IGF-1基因亚型、Ki-67表达的差异性及其与临床资料的相关性，旨在为结肠癌预防找寻新的治疗靶点，现报道如下。

大剂量伽玛刀照射后脑组织一氧化氮合酶亚型表达改变及其与急性脑水肿的关系

目的探讨大剂量伽玛刀(γ刀)照射后脑组织一氧化氮合酶(NOS)亚型表达改变及其与急性脑水肿的关系。方法200Gy量γ刀照射正常大鼠脑,采用光镜、电镜、免疫组化及原位杂交技术研究照射后急性脑水肿的发生发展及脑组织NOS亚型表达变化。结果①照射后30min出现急性脑水肿病理改变,照射后2h出现明显血管源性脑水肿,照射后6h出现明显细胞性脑水肿,照射后3d急性脑水肿达高峰。②脑组织NOS亚型表达在照射后30min开始增高,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达分别于照射后2h及6h显著增高,神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达亦增高,但nNOS阳性表达细胞数量较少。3种NOS亚型表达增高持续时间长,伴行于脑水肿的急性发展阶段。结论大剂量γ刀照射后脑组织NOS亚型表达增高与急性脑水肿的发生发展有关。

淫羊藿苷对动脉性ED模型大鼠阴茎海绵体压力和一氧化氮合酶亚型表达的影响

目的 建立动脉性勃起功能障碍大鼠模型 (arteriogenicerectiledysfunction ,A -ED) ,研究淫羊藿苷 (Icariin)对A -ED大鼠勃起功能和一氧化氮合酶 (NOS)三种亚型表达的影响。方法 4 0只Wistar大鼠随机分为假手术组 (A组 )、A -ED组 (B组 )、A -ED低剂量淫羊藿苷治疗组 (C组 )和AED高剂量淫羊藿苷治疗组 (D组 )。结扎大鼠双侧髂内动脉建立A -ED动物模型后 ,C组和D组每天口饲不同剂量的淫羊藿苷 ( 5mg/kg ,10mg/k) ,A组和B组口饲等体积的生理盐水。 30d后 ,通过检测各组大鼠阴茎海绵体压力 (ICP)变化评估淫羊藿苷对大鼠勃起功能的效果 ,切取阴茎海绵体组织 ,通过逆转录 -PCR和Western印迹方法检测N0S亚型的表达变化。结果 建立A -ED模型 30d后 ,B组ICP较手术前显著降低 ,N0S三种亚型的表达水平也显著降低。经淫羊藿苷治疗后 ,C组和D组的ICP比B组明显升高 (P <0 .0 1) ,且D组较C组增高效果明显 ;C组和D组的eNOS表达水平较之B组有所增高 ,与ICP的变化有相同的趋势。C组的iNOS表达水平有一定程度的升高。治疗后nNOS表达水平没有明显增高。结论 经淫羊藿苷治疗后大鼠勃起功能显著改善 ,这种功能改善与eN0S的表达增加有相同的趋势 ,提示淫羊藿苷可能通过恢复eN0s的表达来改善A -ED模型的勃起功能。

膀胱癌组织βhCG mRNA及其亚型表达分析

目的 探讨 βhCG基因表达与膀胱肿瘤临床生物学的关系。 方法 采用RT PCR法 ,结合限制性内切酶分析对 37例膀胱癌组织进行 βhCGmRNA及其亚型表达的检测。 结果 37例癌组织中 βhCGmRNA阳性 2 6例 (70 % )。阳性表达率与肿瘤病理分级无关 (P >0 .0 5 ) ;浸润性肿瘤 (13/ 14)较浅表性肿瘤 (13/ 2 3)阳性率高 (P <0 .0 1) ;浅表性肿瘤主要表达 β7基因 ,而浸润性肿瘤多同时表达 3个或以上 βhCGmRNA亚型。 结论 膀胱肿瘤 βhCGmRNA表达与肿瘤临床分期相关。同时表达多个 βhCGmRNA亚型提示肿瘤分化差 ,易浸润。

膀胱出口梗阻引起逼尿肌肌球蛋白重链亚型表达改变的实验研究

目的检测膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌肌球蛋白重链亚型表达改变。方法雄性新西兰白兔14只,分为梗阻组和对照组,每组7只。梗阻组行手术部分结扎膀胱颈部,制成BOO动物模型。5周后两组均切除膀胱并测定膀胱重量、容量,提取逼尿肌组织蛋白,行聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白印迹法检测平滑肌肌球蛋白重链亚型(SM1和SM2)表达的改变;提取逼尿肌组织mRNA行RTPCR反应检测平滑肌肌球蛋白重链亚型SM1和SM2mRNA表达的改变。结果梗阻组和对照组膀胱重量分别为(13.8±4.4)g和(3.7±0.5)g,P<0.01;两组膀胱容量分别为(70.4±18.9)ml和(109.0±29.0)ml,P<0.05。梗阻组肌球蛋白重链亚型SM2∶SM1为1.2∶1.0,SM2mRNA∶SM1mRNA为1∶1。对照组分别为3∶1和3∶1。结论逼尿肌肌球蛋白重链亚型SM1、SM2的表达与逼尿肌的功能状态密切相关,随着SM1、SM2比例的改变,肌肉收缩功能亦发生相应变化。

早期糖尿病大鼠视网膜一氧化氮合酶亚型表达与血流动力学变化的关系

目的探讨糖尿病早期3种一氧化氮合酶(NOS)亚型在视网膜中的蛋白表达及其与视网膜血流动力学变化的关系.方法将20只Wistar大鼠随机分为对照组与链脲佐菌素腹腔注射诱导的糖尿病组,每组各10只.采用彩色多普勒检测2组大鼠视网膜中央动脉(CRA)的收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期最低流速(EDV)、阻力指数(RI)及搏动指数(PI),并采用免疫组织化学分析法观察视网膜内皮型NOS(eNOS)、诱导型NOS(iNOS)和神经元型NOS(nNOS)的蛋白表达.结果饲养8周后检测糖尿病组大鼠视网膜尚未出现明确病变,但大鼠视网膜CRA的PSV、EDV较对照组降低(P＜0.05),而RI、PI出现升高趋势(P＞0.05).2组NOS的3种亚型在视网膜的蛋白表达部位一致,但糖尿病组iNOS的蛋白表达增强,eNOS与nNOS蛋白表达未见明显变化.结论糖尿病早期视网膜血流动力学的异常可能与iNOS的表达增强有关.

H_9N_2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。

成人成骨细胞和MG-63细胞株孕激素受体的表达

目的 观察成人成骨细胞和MG-63细胞株孕激素受体(progesterone receptor,PR)亚型表达的情况。方法用改良胶原酶消化法从正常成人松质骨中分离成骨细胞,观察细胞形态,钙钴法行碱性磷酸酶染色,Van Gieson法行Ⅰ型胶原染色,茜素红行矿化结节染色;半定量RT-PCR检测骨钙素和PR亚型mRNA表达;Western blot测定PR蛋白质表达。结果所分离培养的细胞具有成骨细胞的形态特征,保持了其在体内的功能;人成骨细胞和MG-63细胞株均表达PRA、PRB mRNA和蛋白质。结论人成骨细胞和MG-63细胞株可能受孕激素的影响。

大鼠背根神经节P2Y1与P2Y4嘌呤受体的表达比较

目的:探讨P2Y1和P2Y4亚基在大鼠背根神经节(D R G)神经元的表达。方法:应用组织水平和多细胞水平R T-PC R方法从不同角度检测了P2Y1和P2Y4受体的表达情况。结果:两种R T-PC R扩增结果均显示:P2Y1亚型有特异性表达阳性条带出现,而P2Y4亚型则无特异性表达条带出现。结论:大鼠D R G的大、中、小细胞中均有P2Y1亚型表达,而无P2Y4亚型的表达。

蛋白激酶Cα、δ和ε亚型与缺血/运动预处理研究进展

1986年Murry等[1]发现,预先给予狗心脏几次短暂的缺血再灌注处理,会使其心肌对随后长时间缺血损伤的耐受性增强,这种现象称为缺血预处理（ischemic preconditioning,Ip）[2-4].由运动诱导的IP样心肌保护效应,称为运动预处理（exercisepreconditioning,Ep）[5-7].EP具有与IP类似的保护效应和信号转导通路[s,s-13],但具体机制尚不清楚.在各种预处理效应机制中,蛋白激酶C （protein kinase C,PKC） α、δ和ε亚型是中介环节的关键点.在EP现象中,PKCα、δ和ε亚型表达和分布变化以及三者的交互作用（Cross-Talk）对EP效应的最终产生有重要影响.本文对蛋白激酶Cα、δ和ε亚型及其交互作用在缺血预处理和运动预处理心肌保护作用中的变化及可能机制进行综述.

大鼠背根神经节神经元P2Y嘌呤受体的表达

目的 探讨P2Y1和P2Y4亚基在大鼠背根神经节(DRG)神经元的表达。方法 应用组织水平和多细胞水平RT -PCR方法从不同角度检测了P2Y1受体的表达情况。结果 两种RT -PCR扩增结果均显示:P2Y1亚型有特异性表达阳性条带出现,而P2Y4亚型则无特异性表达条带出现。结论 大鼠DRG的大、中、小细胞中均有P2Y1亚型表达。

pS2、ER-α、ERβ在卵巢上皮性癌的表达

目的 了解上皮性卵巢癌雌激素受体调节蛋白(pS2)、雌激素受体(ER)α、β亚型表达在上皮性卵巢癌中的作用及意义。方法 选取68例上皮性卵巢癌、15例良性卵巢上皮性肿瘤患者的石蜡病理切片，用SP免疫组化法测定pS2、ERα、ERβ蛋白表达情况，并与临床病理特征进行比较。结果 pS2阳性染色定位于细胞质内，ERα、ERβ阳性染色均位于细胞核内。卵巢上皮性癌中，pS2阳性率为50％(34／68)、ERα(+)53．2％(36／68)与良性肿瘤接近(46．7％)：ERβ(+)9．36％(6．68)，显著低于良性肿瘤(53．3％)，ER阳性率在卵巢浆液性癌、中低分化及Ⅲ、Ⅳ期癌中显著低于ERα(P<0．01)。结论 pS2细胞质受体，ERα、β为核受体。原发性上皮性卵巢癌中ERβ阳性率显著降低，pS2、ERα/ERβ升高可能为卵巢癌发生的一个标志。pS2、ERα、ERβ可能提示预后。

hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力。结论成功构建pGEX-5X-1-β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础。

大鼠耳蜗组织中Nedd4及SGK1的表达

目的研究大鼠耳蜗组织中神经前体细胞表达-发育性下调基因亚型(neural precursor cell-ex-pressed,developmentally downregulated isoforms,Nedd4)及血清糖皮质激素诱导激酶1(serum glucocorticoid-in-ducible kinase1,SGK1)蛋白分子的表达。方法选取健康Wistar大鼠8只,用特异性多克隆兔抗鼠Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1抗体,采用免疫组化法研究大鼠耳蜗组织中Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1蛋白的表达模式。结果Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1蛋白广泛表达于大鼠耳蜗组织的各个区域中,包括血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋缘、螺旋神经节、前庭膜等处。结论在耳蜗组织中,存在一个由SGK1、Nedd4和上皮钠通道(ENaC)组成的Na+转运系统,它们协同作用转运Na+,从而保持内耳内环境的稳定。

生长抑素受体亚型在结直肠癌组织中的表达

目的 探讨结直肠癌组织中生长抑素受体亚型(SSTR1 SSTR5 )的表达和临床病理学意义。方法 免疫组织化学染色方法(SP法)检测12 7例结直肠癌组织和40例正常结直肠黏膜中SSTR 5种亚型的表达。结果 SSTR 5种亚型在结直肠癌组织和正常结直肠黏膜均有表达,两组SSTR表达的优势亚型都是SSTR1,结直肠癌组织中SSTR4表达明显高于正常结直肠黏膜(18.9%比2 .5 % ,P <0 .0 5 )。SSTR2、SSTR4、SSTR5在中高分化结直肠癌表达明显高于低分化结直肠癌表达(P <0 .0 5 ) ;淋巴结转移的结直肠癌SSTR1表达明显高于无淋巴结转移者(72 .2 %比5 4.5 % ,P <0 .0 5 ) ;溃疡型结直肠癌SSTR2表达明显降低(P <0 .0 5 ) ;此外,SSTR1表达率随Dukes分期呈升高趋势,而SSTR3 ,SSTR5则呈下降趋势,但没达到统计学水平。SSTR5种亚型表达均与患者年龄、性别、肿瘤位置、浸润深度、远处转移无明显相关。结论 结直肠癌组织中SSTR1是优势表达亚型,SSTR2、SSTR4、SSTR5亚型表达与癌恶性程度有关,可能在结直肠癌发展过程中发挥重要作用。

金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα和ERβmRNA水平的调节

目的:研究金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα,ERβmRNA的调节作用,探讨植物雌激素对子宫内膜癌的作用机制,为临床应用植物雌激素提供理论依据。方法:体外培养子宫内膜癌细胞系Ishikawa,采用实时荧光定量RT PCR方法,观察不同剂量金雀黄素对两种雌激素亚型表达的影响,阳性对照为雌二醇、孕酮作用组。结果: (1)低剂量金雀黄素能提高子宫内膜癌细胞ERαmRNA表达,但其作用较雌二醇明显弱;低剂量金雀黄素能降低ERβmRNA的表达,而雌二醇对ERβmRNA作用不明显。(2)高剂量金雀黄素的作用与孕酮相似,能下调子宫内膜癌细胞ERαmRNA和ERβmRNA表达,但较孕酮作用弱。结论:金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERαmRNA和ERβmRNA的表达作用不同,而且与其剂量有一定关系。推测金雀黄素有雌激素受体调节剂的作用。