瞬时受体电位香草酸亚型2在肿瘤发生过程中的作用

瞬时受体电位香草酸亚型2(TRPV2)属于瞬时受体电位离子通道家族,是一种非选择性阳离子配体门控通道。现有研究表明TRPV2在某些癌症类型和肿瘤细胞系中表达过量,在一些癌细胞中,通过TRPV2的激活剂(生长因子、激素、大麻素)激活TRPV2,发现TRPV2参与肿瘤细胞生长、细胞死亡和转移,因此TRPV2对肿瘤的发生具有重要作用。我们就TRPV2在膀胱肿瘤、前列腺肿瘤和神经胶质瘤中的影响做简要综述。

钙黏素亚型2在干细胞分化中的作用

细胞间粘连的物理作用和生物化学信号对于干细胞系的分化起至关重要的作用。钙黏素是细胞粘连分子中的重要一员,钙黏素亚型2(cadherin-2,CDH2)调节的信号在干细胞分化中起重要作用。可以应用表面化学及微拓扑工程技术精准调节细胞间粘连的程度,进而实现调控干细胞的分化。这些研究会促进新技术产生,使实时监控干细胞分化成为可能,并有利于设计出控制干细胞分化的生物材料及支架,其将在组织工程与再生医学方面有潜在的应用价值。

钠钙交换体亚型2在大鼠逼尿肌细胞中的表达与功能

目的检测大鼠逼尿肌细胞是否表达钠钙交换体亚型2(NCX2),并测试其功能。方法 10只大鼠(7只雌性,3只雄性)为实验对象,取膀胱组织为实验组,大脑组织为对照组。首先利用急性酶分离技术,制备和培养大鼠逼尿肌细胞,再采用反转录-聚合酶链式反应和免疫印迹技术,检测大鼠膀胱组织中是否表达NCX2基因及蛋白;免疫荧光技术进一步明确NCX2与逼尿肌细胞的关系;膜片钳技术测试逼尿肌细胞是否存在NCX2电流。结果首先制备了光镜下以梭形为主,免疫组化染色α-actin呈阳性的逼尿肌细胞;利用逆转录-聚合酶链式反应,在大鼠大脑组织、膀胱组织中分别发现NCX2 mRNA表达;免疫印迹技术在上述组织中检测NCX2的蛋白相对表达量,差异均未见统计学意义;免疫荧光双抗进一步证实NCX2蛋白与逼尿肌细胞共表达;膜片钳检测到逼尿肌细胞上的NCX2电流,电流密度为(0.79±0.45)p A/p F。结论发现NCX2表达于大鼠逼尿肌细胞,电生理证实NCX2具有维持逼尿肌细胞内钙离子平衡的能力,其生理作用需要进一步的探索。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

2022—2023年北京市通州区甲型H3N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析

目的分析2022—2023年北京市通州区流感病原学监测中甲型H3N2亚型流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因特性,为流感防控提供科学依据。方法对通州区2022—2023年流感病原学监测结果进行统计分析,选取不同时间分离到的34株甲型H3N2亚型流感毒株,进行HA基因扩增和测序,应用MEGA11进行HA基因的核苷酸和氨基酸变异分析,采用邻接法构建HA基因遗传进化树,在线预测N-糖基化位点,分析其基因变异和进化特征。结果2022—2023年共检测流感病原学监测样本3660件,流感病毒核酸阳性率为21.50%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为57.81%。发热疫情样本共计4855件,流感病毒核酸阳性率为54.25%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为61.50%。34株甲型H3N2亚型流感病毒的HA基因序列与疫苗株A/Darwin/9/2021相比,核苷酸相似度为97.00%~98.50%,氨基酸相似度为97.40%~98.10%。基因进化分析显示,2022—2023均分布在3c.2a1b.2a分支,2022年8—11月分离的14株毒株分布在1a.1亚分支,2023年2—3月分离的20株毒株则分布在2a.3a.1亚分支。与疫苗株相比,2022—2023年的34株毒株在4个抗原决定簇上(B、C、D和E)发生了多位点氨基酸变异,且在186和225位点上均发生了替换。2022年的14株毒株,增加了158NYTY位点,存在13个潜在糖基化位点,2023年的20株分离株122NESF糖基化位点丢失,共有12个潜在糖基化位点存在。结论2022—2023年,北京市通州区人群中流行的甲型H3N2亚型流感病毒分布在2个进化分支上,2023年3C.2a1b.2a.2a.3a.1分支取代了2022年3C.2a1b.2a.1a.1分支,成为流行株。及时分析流感病毒基因特性和进化趋势,对流感的防控有重要意义。

ABO基因第7外显子c.539G>C突变致A_(2)B亚型结果分析

目的:探讨ABO基因第7外显子c.539G>C突变致A_(2)B亚型结果分析。方法:采用试管凝集法检测ABO血型,采用Sanger测序法进行基因测序及序列分析。结果:4例先证者红细胞为A弱B表型,根据血清学特征定义为A_(2)B血型,先证者1、3、4血清中无抗-A_(1)抗体;先证者2血清中存在抗-A_(1)抗体;4例血型基因型为ABO^(*)A2.08/ABO^(*)B.01,测序结果与A102基因序列比对,A208在c.467C>T和c.539G>C位发生突变,导致多肽链P156L和R180P替换。结论:α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因c.539G>C突变产生A208表型。

一株H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株产生原因的分析

目前,H9N2亚型禽流感病毒是我国最主要的低致病性禽流感病毒,造成禽养殖业的严重经济损失。H9N2禽流感病毒灭活疫苗是防控该疫病的最有效方式,然而,H9N2病毒在免疫压力下容易产生抗原变异,导致疫苗免疫失败,其机制尚不清楚。在前期研究中,我们通过模拟H9N2禽流感免疫压力筛选出携带HA_(D201N)单点突变的逃逸株,但HA_(D201N)如何导致H9N2病毒逃逸株出现的原因尚不明确。为此,本研究利用8质粒反向遗传技术方法拯救出1株A/Chicken/Shanghai/1/2006(H9N2)(简称SH1)及其免疫逃逸株rSH1-HA_(D201N)。为了鉴定HA_(D201N)是否通过影响H9N2禽流感病毒复制能力而导致病毒发生免疫逃逸,用0.001 MOI的病毒接种MDCK并测定其生长曲线,结果表明HA_(D201N)点突变可显著降低rSH1病毒的复制能力,且病毒复制能力的变化不是rSH1病毒发生逃逸的主要原因。为了研究HA_(D201N)是否通过影响H9N2病毒抗原变异而产生病毒逃逸株,将原毒株与突变毒株加入佐剂后免疫鸡以制备多克隆抗体血清,利用交叉HI试验,计算R值并分析抗原变异,结果表明rSH1与rSH1-HA_(D201N)的R值为2,说明HA_(D201N)会导致rSH1发生显著的抗原变异,从而使病毒在免疫压力下逃逸。本研究为探索H9N2禽流感病毒抗原变异规律及其疫苗研发奠定了基础。

神经介素B及受体NMBR和PD-L1在H9N2亚型流感病毒感染过程中的相互作用研究

神经介素B(NMB)及其G蛋白偶联受体(NMBR)发挥的抗甲型流感病毒免疫反应,以及甲型流感病毒感染诱导细胞程序性死亡配体1(PD-L1)高表达均与NF-κB信号通路有直接关系,而NF-κB信号通路的激活受ERK信号通路的调控。为深入探究NMB与NMBR调节H9N2亚型流感病毒感染诱导PD-L1上的作用,本研究以H9N2亚型流感病毒为模式毒株,基于NMBR干扰和过表达细胞系、PD-L1干扰和过表达细胞系以及C57BL/6小鼠,采用RT-PCR和Western blot方法分析NMB与NMBR对PD-L1表达变化以及ERK磷酸化的影响。结果显示:H9N2亚型流感病毒感染诱导的NMBR和PD-L1表达之间存在着负调控的关系,外源性NMB可以有效激活小鼠体内NMBR的表达,进而抑制PD-L1表达,NMB与NMBR也能影响H9N2感染诱导的ERK磷酸化水平。综上,H9N2亚型流感病毒感染诱导表达的NMB与NMBR通过ERK信号通路调节PD-L1的表达而发挥抗流感病毒作用,将为深度剖析宿主-甲型流感病毒之间的互作关系提供新的科学依据。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

6株H9N2亚型禽流感病毒分子特征及遗传演化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的分子变化特征及其跨物种传播的可能性,对实验室保存的6株H9N2亚型AIV的8个基因片段进行了序列测定及遗传演化分析,并且对6株病毒与选取的代表毒株进行了HA和NA同源性及关键氨基酸位点分析。结果显示,分离的6株病毒均为欧亚系,其中3株为G57基因型;4株病毒的HA蛋白发生了Q226L突变,2株病毒的HA发生了A190V突变。HA和NA均有增加或缺失的潜在糖基化位点。6株病毒的NA茎部均有62~64位的缺失,红细胞结合位点431~433较为保守,而368和369位变化较大。综上,6株病毒为低致病性AIV,HA和NA均含有哺乳动物适应性突变,增大了其跨宿主传播的风险。研究结果为我国H9N2亚型AIV的进化提供了参考依据,为其综合防控提供了理论指导。

云南野鸟源H9N2亚型AIV的遗传进化分析

【目的】分析云南纳帕海国际重要湿地H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的遗传进化和分子特征,掌握H9N2亚型AIV在野禽中的流行特点,为禽流感疫情防控提供数据支持。【方法】采集2022―2023年云南省香格里拉纳帕海国际重要湿地野禽粪样及其周边家禽喉头、泄殖腔和环境水样,经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚分离病毒,结合HA试验和RT-PCR扩增鉴定AIV亚型。利用MBTuni-12/13引物同时扩增H9N2亚型AIV毒株的8个基因(HA、NA、M、PB2、NS、NP、PA及PB1)节段,利用二代测序获取全基因组序列,并分析遗传进化关系及关键氨基酸突变位点。【结果】分离到的4株野鸟源H9N2亚型AIV的HA、NA基因源自Y280-like亚系,M、PB 2基因为G1-like亚系,NS、NP、PA、PB 1基因为F/98-like亚系,表明4株分离株为多种亚型的重组毒株,重组模式与2013年以后在中国流行的G57基因型一致。序列相似性分析结果显示,4株H9N2亚型AIV分离株内部基因与H7N9、H5N6、H5N2等亚型AIV相似性较高,遗传多样性特征突出。HA蛋白裂解位点均符合低致病性禽流感特征,获得了多个可增加跨种感染风险及与哺乳动物致病力增强相关的氨基酸突变位点,包括A198T、Q234L、N166D(HA),I292V、A558V(PB2),I368V、L13P(PB1),N30D、T215A(M1),以及P42S(NS1)等。4株野鸟源H9N2亚型AIV毒株具有家禽源同亚型毒株特征,野禽源AIV可能源于家禽。【结论】从云南纳帕海国际重要湿地分离到的4株野鸟源H9N2亚型AIV可能是由家禽传播的多源重配病毒,属于G57基因型,且具有多个适应哺乳动物宿主相关的氨基酸突变位点。

2023年江苏常州地区H9N2亚型禽流感病毒遗传演化与抗原性分析

试验旨在调查H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月,在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展H9N2亚型AIV流行病学调查,试验采集鸡、鸭、鹅、鸽等咽拭子、组织样品以及环境拭子共计1970份,进行AIV分离及其流行病学特征分析,并对分离的H9N2亚型AIV进行遗传演化、关键氨基酸与糖基化位点和抗原性分析。结果显示:共鉴定出73株H9N2亚型AIV,平均分离率为3.70%;4月和5月分离率较高,分别为7.07%和8.00%;分离地点中活禽市场和交易平台的分离率最高;H9N2亚型AIV在鸡、鸭、鸽、野鸟粪便和环境中均有分离,在环境和鸡中的分离率最高,分别为6.90%和4.15%;分离的H9N2亚型AIV属于欧亚谱系9.1分支中Group2群,与2021—2023年多个地区人感染H9N2亚型AIV亲缘关系较近;与参考株序列相比,H9N2亚型AIV分离株HA蛋白的130-loop、150-loop及190-helix存在明显氨基酸多态性,但没有发现新的糖基化位点;H9N2亚型AIV分离株均属于当前优势流行的抗原群,尚未发生明显抗原漂移。综上所述,江苏常州地区H9N2亚型AIV流行的热点场所是活禽市场和交易平台,提示环境消毒是控制病毒传播和污染的关键手段;H9N2亚型AIV可能在野生禽类中流行,须减少家禽与野禽接触;并且H9N2亚型AIV分离株HA蛋白受体结构域变异可能对人间感染造成持续威胁,值得关注。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

天蚕素对H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒和禽致病性大肠杆菌共感染肉鸡的干预作用

试验旨在探讨天蚕素对H_(9)N_(2)亚型禽流感病毒(AIV)与禽致病性大肠杆菌(APEC)共感染致炎性渗出的干预效果,为临床H_(9)N_(2)亚型AIV与APEC共感染的有效防治提供参考。试验选取150只14日龄白羽肉鸡,随机分为5组,每组3个重复,每个重复10只鸡。对照组肉鸡使用无菌生理盐水0.2 mL滴鼻,APEC感染组肉鸡使用含2.09×109 CFU APEC O2菌株肉汤0.2 mL滴鼻,H_(9)N_(2)感染组肉鸡使用H_(9)N_(2)病毒尿囊液(约105 EID50 H_(9)N_(2)病毒)0.2 mL滴鼻,H_(9)N_(2)+APEC感染组肉鸡使用0.2 mL APEC O2菌株肉汤离心后的沉淀与0.2 mL H_(9)N_(2)病毒尿囊液混匀得到的病毒尿囊液滴鼻,H_(9)N_(2)+APEC干预组肉鸡采用与H_(9)N_(2)+APEC感染组相同处理后,使用天蚕素饮水(300 mg/kg)+基础饲粮饲喂,其余各组正常饮水+基础饲粮饲喂。正式试验期21 d。结果显示,H_(9)N_(2)+APEC感染组肉鸡临床症状极为明显,死亡率显著升高(P<0.05),气管和肺脏病变最为严重。与H_(9)N_(2)+APEC感染组相比,H_(9)N_(2)感染组和APEC感染组在感染后第3、7、14、21 d时的H_(9)N_(2)病毒拷贝数和APEC载量均显著降低(P<0.05);H_(9)N_(2)+APEC干预组在感染后第3、7、14、21 d时的H_(9)N_(2)病毒拷贝数均显著降低(P<0.05),H_(9)N_(2)+APEC干预组在感染后第7、14、21 d时的APEC载量均显著降低(P<0.05)。研究表明,天蚕素可以缓解H_(9)N_(2)亚型AIV、APEC以及两者共感染引起的肉鸡呼吸道症状,降低死亡率,其机制与天蚕素降低病原在组织内的载量及修复呼吸系统、改善呼吸机能有关。

M1基因模式差异对H9N2亚型禽流感病毒增殖特性的影响

为探究基质蛋白1(M1)对H9N2亚型禽流感病毒适应性的影响,研究基于M1的5种主要模式,利用反向遗传技术拯救了5株具有不同M1基因模式的H9N2亚型禽流感病毒,通过测定病毒的一步与多步生长曲线以及生长竞争优势试验探讨M1对H9N2亚型禽流感病毒增殖能力的影响,将MOI均为0.001的5株病毒共感染MDCK细胞,感染后48h提取细胞上清的病毒RNA,将反转录的cDNA样品进行单核苷酸多态性(SNP)测序。结果显示:M1为P5模式的H9N2亚型禽流感病毒增殖能力显著高于其余4株病毒(P<0.05),P5模式病毒的M1基因所涉及的9个可检测的氨基酸位点占比超过74%。研究表明,M1为P5模式的H9N2亚型禽流感病毒具有最强的增殖能力和明显的生长竞争优势,结果从M1对病毒增殖能力影响角度解释了该分支病毒在我国禽群中广泛流行的原因。

H9N2亚型禽流感病毒感染鸡呼吸道应答模式研究

【目的】通过建立H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染鸡上呼吸道炎症模型,探索其感染鸡上呼吸道引起的炎症反应。【方法】将H9N2亚型AIV流行毒株GD10142,按照100μL/只(108 EID 50/100μL)的剂量通过滴鼻点眼方法感染SPF鸡,并在感染后观察鸡的临床特征,采集感染后0、1、3、5、7、9 d的咽拭子和血清样品;感染后5和9 d剖检观察鸡的呼吸道和肺脏病理变化,收集气管灌洗液、气管和肺脏组织;通过实时荧光定量PCR检测咽拭子、气管灌洗液、气管和肺脏组织中的病毒载量;应用ELISA方法检测感染后血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG的变化规律,通过血清中和试验分析血清中和抗体的活性;通过ELISA方法检测血清和气管灌洗液中炎症相关细胞因子白细胞介素6(IL-6)、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子κB(NF-κB)的水平。【结果】H9N2亚型AIV感染后鸡没有出现典型的临床特征,但感染后1~5 d在咽拭子中可检测到病毒核酸,且感染3 d后病毒载量最高,感染5 d后检测不到病毒核酸;感染5 d时,在气管灌洗液、气管和肺脏检测到病毒核酸,其中前两者载量高于肺脏;血清总IgG和H9N2亚型AIV特异性IgG在感染后3 d增多,感染后5~9 d维持较高水平,且具有较强的病毒中和活性;血清IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB也在感染后3 d开始呈上升趋势;但气管灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和NF-κB含量很低,且感染前后无明显变化。【结论】本研究成功建立了H9N2亚型AIV感染鸡呼吸道模型,确定上呼吸道是H9N2亚型AIV主要感染和增殖部位,H9N2亚型AIV感染诱导机体产生促炎和抑炎细胞因子,可能是感染动物维持免疫稳态的重要因素。本研究为深入探索H9N2亚型AIV的致病机制和宿主防御机制奠定了基础。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

鸽H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及致病性试验

H9N2亚型禽流感病毒属于A型流感病毒,目前H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染家禽,而且可以感染猪、猫等哺乳动物,甚至出现人类感染现象。因此,H9N2亚型流感病毒不仅影响畜禽的健康养殖,同时也具有一定的公共卫生学意义。近年来鸽群感染流感病毒时有报道,这其中包括H5N1、H7N9以及H9N2亚型禽流感病毒。虽然H9N2亚型禽流感毒株的致病性相对于H5和H7亚型较低,但是该亚型病毒在我国家禽中存在较为普遍,且目前从鸽子已分离到重组的H9N2毒株,该毒株不仅引起鸽子感染而且具有优先与人类呼吸道表面受体结合的能力,因此加强流感病毒在鸽群中流行情况具有重要的现实意义。