新型冠状病毒亚基因组RNA检测方法的建立及性能评估

目的建立检测新型冠状病毒(新冠病毒)亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)的方法,并对所建立的方法进行性能评估。方法根据新型冠状病毒sgRNA序列设计引物和探针,建立检测sgRNA的实时荧光逆转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,对所建立的方法进行优化,包括引物、探针的浓度及比例、延伸温度、反应体积和模板量。并对所建立的方法进行性能评估,包括最低检测限、灵敏度、特异性和重复性。对临床样本进行新冠病毒sgRNA和基因组RNA(genomic RNA,gRNA)检测,并对检测结果进行分析。结果建立了检测新冠病毒sgRNA的RT-PCR方法。所建方法的最低检测限为100 copies/mL,对常见病原体的检测结果均为阴性。对高、中、低浓度样本sgRNA进行检测,CV均<5%。115例疑似新冠病毒感染者的咽拭子样本sgRNA为阳性(115/330,阳性率为34.85%)。gRNA-N Ct值<30时,sgRNA-N的阳性率为100.00%;gRNA-N的Ct值介于30~32时,sgRNA-N的阳性率为68.75%;gRNA-N的Ct值介于32~35时,sgRNA-N的阳性率为44.44%;gRNA-N的Ct值>35时,sgRNA-N均为阴性。结论建立了新冠病毒sgRNA的RT-PCR检测方法,方法灵敏、特异、重复性好。

低温电镜术证实了兔出血症病毒亚基因组颗粒的存在

从病兔肝细胞分离纯化的兔出血症病毒 ( RHDV)的低温电镜术显示出存在两种核心密度有明显差异的颗粒——高密度颗粒和低密度颗粒 ;而病毒的负染电镜术则显示出绝大多数病毒颗粒具有完整病毒颗粒的形态。结构分析表明高密度颗粒和低密度颗粒具有相同的衣壳结构 ,且不存在释放核酸的通道。对低密度颗粒核心区的密度分析表明相当数量的颗粒并非空衣壳。我们认为这部分低密度颗粒是含病毒亚基因组 RNA的病毒颗粒 ,从而为兔出血症病毒在复制过程中其 7.5kb基因组和 2 .2 kb亚基因组 RNA分别包装成病毒颗粒提供了结构证据。

猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N^(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。

红背叶根体外抑制HCV亚基因复制子RNA表达活性部位筛选研究

目的:筛选红背叶根体外抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制的活性部位。方法:以HCV亚基因复制子体外培养体系CBRH7919(Jneo3-5B)为HCV复制模型,选用干扰素α联合利巴韦林为阳性对照药物,观察不同浓度红背叶根总提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的抗HCV作用。采用荧光定量PCR检测HCV亚基因复制子RNA拷贝数,通过Western blot检测HCV功能蛋白NS3的表达,采用CCK-8法观察药物对细胞生长的影响。结果:红背叶根4种提取物中,乙酸乙酯部位对HCVRNA复制的抑制活性最强,对NS3蛋白表达有明显干预作用,对HCVRNA表达表现出剂量依赖的抑制作用(P<0.05)。其比活较初始总提取物提高5.71倍,对HCVRNA半数抑制浓度为14.60mg/L,对CBRH7919(Jneo3-5B)细胞半数细胞毒性浓度为40.30mg/L,治疗指数为2.76。结论:红背叶根乙酸乙酯部位可抑制HCV的复制,为抗HCVRNA表达的活性部位,在抗HCV方面有着潜在的用途。

基因工程重组人乳头瘤病毒亚基因致癌的分子生物学及超微结构研究

我们用基因分子生物学结合超微结构的方法在318例人宫颈癌标本中证明人乳头瘤病毒16型(HPV-16)与中国妇女宫颈癌的发生关系密切。它的亚基因片段,E_6-E_7早期基因可能是HPV-16的致癌基因。本文采用近年来开始发展起来的基因工程方法,将HPV-16的全部早期区基因及E_6-E_7基因分别重组至逆转录病毒(小鼠白血病病毒)的基因组中,将比重组的逆转录病毒导入培养细胞,在细胞中大量牛成并释放病毒颗粒到培养液中(此细胞称为重组病毒生成细胞)。借助重组病毒感染方式介导基因转移进行体外转化研究。采用重组逆转录病毒感染方式研究属于DNA病毒的HPV-16的致癌潜能,国内外尚未见报道。我们证明它是目前体外研究转化功能效率最高,最稳定的方法。

甘蓝型油菜亚基因组间杂种(A^rA^nC^cC^n)的细胞学和育性研究

以新型甘蓝型油菜(ArArCcCc)与自然甘蓝型油菜品种湘油15(AnAnCnCn)杂交,人工配制了ArAnCcCn油菜亚基因组间杂种。亚基因组间杂种花粉母细胞减数分裂基本正常,中期Ⅰ大多以19个二价体的构型存在,但偶尔也有单价体、三价体和四价体等异常情况出现。在减数分裂后期Ⅰ和后期Ⅱ,绝大多数细胞中的同源染色体和姊妹染色单体正常分离,仅在很小比例的花粉母细胞中观察到落后染色体。不同亚基因组间杂种的减数分裂正常程度存在一定的差别,其中Ar和An基因组之间的遗传分化可能是主要原因。产量分析表明,亚基因组间杂种具有较强的杂种优势潜势,并且亚基因组间杂种的种子产量和正常花粉母细胞所占比例呈显著正相关。

大鼠PTHrP亚基因的克隆及其真核反应质粒的构建

目的:克隆甲状旁腺相关肽(PTHrP)亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为调控PTHrP亚克隆在软骨前体细胞中的表达打下基础。方法:提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段,扩增的DNA片段分别与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果:经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论:成功克隆出PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为进一步精确调控PTHrP亚基因的表达奠定了基础。

HCV亚基因复制子支持细胞的筛选

目的寻找新的支持HCV亚基因复制子复制的支持细胞,为研究HCV复制机制、HCV与宿主间的关系,及建立HCV缺陷病毒培养体系提供材料储备。方法质粒pNNeo3-5B含HCV-N亚基因复制子cDNA,该复制子RNA能在Huh7细胞中有效复制。缺失其中的BsaBⅠ-HpaⅠ片段(含NS5B的GDD基序),生成缺陷型复制子质粒pNNeo3-5B(Δ)。将以上两个质粒线性化后体外转录出复制子RNA:rNNeo3-5B和rNNeo3-5B(Δ)。将rNNeo3-5B电转染Huh7、SMMC7721、HepG2、BEL7402、Lo2、CBRH7919、BHK21、VeroE6、293和293T等细胞,以G418筛选3周,观察克隆形成情况,并检测克隆中HCV特异性RNA和蛋白。结果在CBRH7919和BHK21获得G418抗性克隆,转染rNNeo3-5B(Δ)的细胞和未转染复制子的细胞则全部死亡。RT-PCR检测证实各克隆都含有HCV5′NTR和新霉素磷酸转移酶基因,间接免疫荧光和Westernblot检测证实有大量表达的HCVNS3和NS5A蛋白,未转染复制子的细胞全为阴性。结论本研究证实CBRH7919和BHK21能支持HCV复制子的自主复制,可作为建立HCV病毒培养体系的备选材料。

戊型肝炎病毒亚基因组RNA的研究

本文利用同位素代谢标记在HEV感染 8 5～ 1 0 5,6 5～ 7 5h分别检测到 1及 2个亚基因组RNA ,而感染 2 1h后及在成熟的病毒颗粒内未能检测到亚基因组RNA。通过杂交实验 ,发现HEV的亚基因组RNA具有典型的共 3′端的半套式结构 ,且基因组RNA与亚基因组RNA的 5′端不存在共同的引导序列。通过紫外转录图谱发现HEV的亚基因组RNA是通过独立转录的方式产生的。利用引物延伸反应发现两种亚基因组RNA的转录起始位点分别位于RNA聚合酶区及非结构区、结构区的基因间序列。

HBV亚基因整合及其致癌性研究

目的探讨乙型肝炎病毒亚基因在肝细胞癌发生中的作用。方法以ＢａｍＨＩ、ＢｇｌⅡ酶切３．２ｋｂＨＢＶＤＮＡ，回收其ＨＢｓ、ＨＢｘ、ＨＢｃ、ＰｒｅＳ亚基因片段，以地高辛甙元标记成探针。以ＨＢＶ探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析其存在状态，以ＨＢＶ亚基因探针Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测亚基因转录。结果ＨＢＶ阳性肝细胞癌中，整合型与混合型标本分别为６３．６％和３６．４％，纯整合型标本中，ＰｒｅＳ、ＨＢｓ、ＨＢｘ、ＨＢｃｍＲＮＡ阳性率分别为１１．１％、４４．４％、５５．６％、１１．１％。结论ＨＢＶＤＮＡ以整合于染色体上作为存在的主要方式，整合的ＨＢＶＤＮＡ有一定程度的转录，指导相应蛋白合成而影响肿瘤的发生。

人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达

目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端，为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段，并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ，将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测，检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。

厦门市乙型肝炎病毒亚基因型分布的初步研究

目的探讨厦门地区乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况。方法应用混合性型特异性引物聚合酶链反应法结合琼脂糖电泳,根据PCR产物片段大小直接判定HBV基因型;应用PCR扩增全S基因序列-DNA测序-生物信息学分析方法确定部分样本的亚基因型,并探讨前前S区编码的流行情况。结果在217例可以通过混合性型特异性引物聚合酶链反应法确定基因型的感染者中,B型83例(38.2%)、C型71例(32.7%),B/C混合型63例(29.0%)。HBeAg阳性患者中感染B基因型占50%,B/C型混合感染占22%;抗-HBe阳性患者中B/C型混合感染36%,B型38%;在慢性乙型肝炎患者中,以B基因型多见(46%),在肝硬化和肝癌患者中,以C(41%和42%)或B/C混合基因型(38%和33%)感染为主;20例患者血清经过DNA测序-生物信息学分析方法确定了亚基因型,其中B2亚型2例,C2亚型18例,其中混合性型特异性引物聚合酶链反应判断为B型的4例经过测序分析为C2亚型。B2亚型不编码前前S区,18例C2亚型均编码前前S区。结论本研究提示厦门地区乙型肝炎患者群的HBV基因型B、C型的感染率大致相同,亚基因型分析提示C2亚基因型占90%,可能是B/C基因型重组的结果。C2亚基因型病毒株均编码前前S区,提示前前S区的编码可能具有亚基因型特异性。

从带烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组启动子的负链RNA产生正链RNA

克隆了能在植物中表达白喉毒素Ａ链基因（ＤＴＡ）负链ＲＮＡ的基因ＴＣＤＴＡＮ。这个基因的读码框５’端上游带有ＴＭＶ外壳蛋白基因５＇端上游６３１个碱基。它的ＤＮＡ和ＴＭＶ－ＲＮＡ共转化烟草原生质体后，能抑制同时导入原生质体的ＣＡＴ基因的表达。ＣＡＴ基因表达的抑制，是ＴＣＤＴＡＮ基因产生白喉毒素Ａ链蛋白的结果。ＴＣＤＴＡＮ基因上ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游片段，是产生白喉毒素Ａ链ｍＲＮＡ的必要条件。只有用多量产负链ＤＴＡＲＮＡ的质粒ＤＮＡ和ＣＡＴ基因同时转化时，原生质体的ＣＡＴ基因蛋白水平的表达才会受到明显的抑制。在用ＴＭＶ接种的试验中发现，用表达在读码框５’端上游带ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游６３１个碱基ＣＡＴ负链ＲＮＡ的ＴＣＣＡＴＮ基因转化得到的烟株，测不出ＣＡＴ活性；用ＴＣＤＴＡＮ基因转化得到的烟株，也不能抗ＴＭＶ感染。

HBV相关肝细胞癌中HBV亚基因整合与表达研究

目的 探讨乙型肝炎病毒亚基因在肝细胞癌发生中的作用。方法 以BamH I、Bgl Ⅱ酶切32kb HBV DNA，回收其HBs、HBx、HBc、PreS亚基因片段，以地高辛甙元标记成探针。以HBV探针Southern杂交分析其存在状态，以HBV亚基因探针Northern杂交检测亚基因转录。结果 HBV阳性肝细胞癌中，整合型与混合型标本分别为63．6%和36．4％，纯整合型标本中，PreS、HBs、HBx、HBc mRNA阳性率分别11．1％、44．4％、55．6％、11．1％。结论 HBV DNA以整合于染色体上作为存在的主要方式，整合的HBV DNA有一定程度的转录，可指导相应蛋白合成而影响肿瘤的发生。

人乳头瘤病毒与中国妇女宫颈癌相关性的研究(Ⅳ.子宫颈癌组织中HPV—16基因组亚基因片段的检测)

本研究以a—^(32)P—dCTP标记的HPV—16基因组中三组亚基因片段为探针,应用制(?)内切酶技术和Southern印迹杂交方法进一步分析了9例HPV—16基因组已发生整合宫颈癌组织DNA中HPV—16基因组各亚基因片段存在的情况。结果表明,在整合状态下,PV—1基因组的部分L1 L2区和大部分E2 E4区是缺失的,而HPV—16基因组的E6 E7区■完整地被保留下来。提示HPV—16基因组的缺失区域很可能是其基因组发生断裂整合部位,而HPV—16基因组的E6 E7区可能是其导致细胞恶性转化的致癌基因。

支持HCV 1b亚基因组复制的细胞模型的建立

目的建立一个稳定支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型。方法构建中国人群HCV1b亚型亚基因组复制子质粒,通过体外转录的方法获得亚基因组复制子RNA,采用电穿孔技术把RNA转染到Huh-7.5.1细胞中,经过G418筛选含有HCV1b亚基因组的细胞集落。RT-PCR检测细胞集落中的HCV亚基因组以及Western blot检测细胞集落中的HCV蛋白的表达。用干扰素(IFN)处理含有HCV亚基因组的细胞,观察细胞中HCV RNA的变化。结果G418药物筛选得到了支持HCV1b亚基因组复制的细胞集落。RT-PCR检测有HCVR NANS4B的表达,Western blot检测有HCV的非结构蛋白NS5B的表达。IFN处理含有HCV复制子的细胞,HCV RNA水平明显降低。结论成功建立了支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型,为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究打下了基础。

N蛋白磷酸化位点突变影响猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制及亚基因组的转录

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的N蛋白磷酸化修饰是否对病毒的复制及亚基因组的转录产生影响,将XH-GD PRRSV N蛋白的已知磷酸化位点Ser-105和Ser-120分别或同时突变为Ala,拯救突变病毒,命名为A105、A120、A105-120,测定其生长曲线和亚基因组的转录水平。结果显示:突变病毒在MARC-145的病毒复制速率与滴度显著低于亲本毒株(P<0.01或P<0.05),而在原代PAMs复制速率降低(P<0.01),不影响病毒最终的滴度。突变毒株的基因组RNA(genomic RNA,gRNA)转录水平显著降低(P<0.01或P<0.05),磷酸化位点突变能显著降低长链亚基因组mRNA(subgenomic RNA,sgmRNA)2、3的转录(P<0.01或P<0.05),但短链sgmRNA4、5表达量随时间呈增加趋势。以gRNA表达量为基准对各亚基因组表达量进行整体分析,发现N蛋白磷酸化显著影响了sgmRNA4和sgmRNA5的表达(P<0.01或P<0.05)。结果提示,N蛋白磷酸化位点突变影响PRRSV的复制及亚基因组转录。

人乳头瘤病毒16型亚基因DNA体外转化功能的细胞学研究

利用HZIP16和HZIP16K(见材料和方法)质粒,将人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的全早期区基因及其开放读码框架(ORF)E6-E7分别转入ψ2细胞,所产生的重组病毒能诱导NIH3T3细胞发生转化。转化细胞具有恶性细胞的生物学和形态学特征,可在0.3％软琼脂中形成集落,可使裸鼠致瘤。Southern blot证明,HPV-16 E6-E7 ORFs序列以整合形式存在于转化细胞和裸鼠肿瘤细胞DNA中,表明HPV-16 DNA具有体外诱导NIH3T3细胞恶性转化的作用,E6-E7 ORFs是诱导细胞转化的关键基因。

玉米亚基因组中代谢基因的分化研究

为了确定玉米代谢通路中2个亚基因组基因的分化情况,对玉米和高粱进行了共线性分析,确定了玉米的2个亚基因组Maize1和Maize2基因组成,统计了玉米所有407个代谢通路中的亚基因组基因保留情况,并对它们的基因长度进行了双样本均值分析(Z-检验)和通路中2个亚基因组基因保留情况进行χ2检验。结果表明,Maize1、Maize2的基因长度没有显著的差异;基因保留具有显著差异的通路大约占总代谢通路的4.4%,作为亚基因组,Maize2在全局上受到更大基因丢失的影响,有更多的DNA丢失,而Maize1相对保留了更多的代谢基因,拥有更大的表达量。

对烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组RNA生成机制的进一步研究

用原生质体瞬间表达的方法证明，在烟草细胞中ＴＭＶ外壳蛋白亚基因组ＲＮＡ的生成，不是通过核酸酶在基因组ＲＮＡ上直接切割，也不是通过在生成负链ＲＮＡ时预成性终止，再从这种负链ＲＮＡ终止部位起始产生的。ＴＭＶ外壳蛋白亚基因组ＲＮＡ是ＴＭＶ识别利用负链ＲＮＡ中间的亚基因组启动子后产生的。这个启动子位于外壳蛋白读码框５’端２５６碱基范围之内，但大于４８个碱基，虽然ＴＭＶ能利用单链的负链ＲＮＡ上的亚基因组启动子产生正链的亚基因组ＲＮＡ，但从双链的ｄｓＲＮＡ上的负链ＲＮＡ产生亚基因组ＲＮＡ的效率，比从单链负链的ＲＮＡ的效率要高得多。很可能在烟草植株中，ＴＭＶ是通过识别和利用双链复制型ＲＦ或复制中间ＲＩ上的负链ＲＮＡ上的亚基因组启动子直接产生的。