从带烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组启动子的负链RNA产生正链RNA

克隆了能在植物中表达白喉毒素Ａ链基因（ＤＴＡ）负链ＲＮＡ的基因ＴＣＤＴＡＮ。这个基因的读码框５’端上游带有ＴＭＶ外壳蛋白基因５＇端上游６３１个碱基。它的ＤＮＡ和ＴＭＶ－ＲＮＡ共转化烟草原生质体后，能抑制同时导入原生质体的ＣＡＴ基因的表达。ＣＡＴ基因表达的抑制，是ＴＣＤＴＡＮ基因产生白喉毒素Ａ链蛋白的结果。ＴＣＤＴＡＮ基因上ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游片段，是产生白喉毒素Ａ链ｍＲＮＡ的必要条件。只有用多量产负链ＤＴＡＲＮＡ的质粒ＤＮＡ和ＣＡＴ基因同时转化时，原生质体的ＣＡＴ基因蛋白水平的表达才会受到明显的抑制。在用ＴＭＶ接种的试验中发现，用表达在读码框５’端上游带ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游６３１个碱基ＣＡＴ负链ＲＮＡ的ＴＣＣＡＴＮ基因转化得到的烟株，测不出ＣＡＴ活性；用ＴＣＤＴＡＮ基因转化得到的烟株，也不能抗ＴＭＶ感染。

杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析

采用DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,Sma I和StuⅠ六种内切酶消化杜氏盐藻(Dunaliella salina)叶绿体基因组DNA,与相应DNA接头连接,构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。利用长距离PCR(long distance-polymerase chain reaction,LD-PCR)技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位(atpA)基因上游序列1 347bp。启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征,根据这些特征设计引物,扩增4个5′端系列缺失的启动子片段,并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建启动子5′端系列缺失重组质粒,以期鉴定不同启动子片段的驱动报告基因转录的活性。基因枪转化结果显示,启动子长度约1 000 bp的重组载体转化盐藻后,其转化株中有黄绿色的盐藻细胞出现。说明克隆的序列具有启动子活性,能驱动绿色荧光蛋白基因在杜氏盐藻中有效表达,为建立盐藻叶绿体转化系统奠定了工作基础。

转录反式激活因子对DNA—PKcs启动子的调控作用

目的检测人类免疫缺陷病毒转录反式激活因子（TAT）对DNA依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA—PKcs）基因启动子活性的影响。方法用PCR方法克隆DNA—PKcs基因启动子的系列截短体，通过DNA重组构建pGL3-basic—DNA—PKcs启动子报告质粒载体，通过双荧光素酶报告基因检测DNA—PKcs基因的启动子活性，采用基于乳糖抑制子和乳糖操纵子并结合绿色荧光蛋白分子荧光的大规模染色质松弛报告系统观察染色质的重构活性，并研究了电离辐射对TAT参与染色体重构的影响。结果构建了DNA—PKcs启动子（全长区域为-939hp--1bp）的系列截短体的报告质粒载体，鉴定出其核心区域为-64hp--1bp。TAT能够抑制DNA—PKcs基因启动子的转录活性。TAT具有大规模的染色体松弛活性，电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用。结论TAT能抑制DNA修复基因DNA—PKcs的肩动子活性，电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用。