红背叶根体外抑制HCV亚基因复制子RNA表达活性部位筛选研究

目的:筛选红背叶根体外抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制的活性部位。方法:以HCV亚基因复制子体外培养体系CBRH7919(Jneo3-5B)为HCV复制模型,选用干扰素α联合利巴韦林为阳性对照药物,观察不同浓度红背叶根总提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的抗HCV作用。采用荧光定量PCR检测HCV亚基因复制子RNA拷贝数,通过Western blot检测HCV功能蛋白NS3的表达,采用CCK-8法观察药物对细胞生长的影响。结果:红背叶根4种提取物中,乙酸乙酯部位对HCVRNA复制的抑制活性最强,对NS3蛋白表达有明显干预作用,对HCVRNA表达表现出剂量依赖的抑制作用(P<0.05)。其比活较初始总提取物提高5.71倍,对HCVRNA半数抑制浓度为14.60mg/L,对CBRH7919(Jneo3-5B)细胞半数细胞毒性浓度为40.30mg/L,治疗指数为2.76。结论:红背叶根乙酸乙酯部位可抑制HCV的复制,为抗HCVRNA表达的活性部位,在抗HCV方面有着潜在的用途。

HCV亚基因复制子支持细胞的筛选

目的寻找新的支持HCV亚基因复制子复制的支持细胞,为研究HCV复制机制、HCV与宿主间的关系,及建立HCV缺陷病毒培养体系提供材料储备。方法质粒pNNeo3-5B含HCV-N亚基因复制子cDNA,该复制子RNA能在Huh7细胞中有效复制。缺失其中的BsaBⅠ-HpaⅠ片段(含NS5B的GDD基序),生成缺陷型复制子质粒pNNeo3-5B(Δ)。将以上两个质粒线性化后体外转录出复制子RNA:rNNeo3-5B和rNNeo3-5B(Δ)。将rNNeo3-5B电转染Huh7、SMMC7721、HepG2、BEL7402、Lo2、CBRH7919、BHK21、VeroE6、293和293T等细胞,以G418筛选3周,观察克隆形成情况,并检测克隆中HCV特异性RNA和蛋白。结果在CBRH7919和BHK21获得G418抗性克隆,转染rNNeo3-5B(Δ)的细胞和未转染复制子的细胞则全部死亡。RT-PCR检测证实各克隆都含有HCV5′NTR和新霉素磷酸转移酶基因,间接免疫荧光和Westernblot检测证实有大量表达的HCVNS3和NS5A蛋白,未转染复制子的细胞全为阴性。结论本研究证实CBRH7919和BHK21能支持HCV复制子的自主复制,可作为建立HCV病毒培养体系的备选材料。

猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N^(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。

支持HCV 1b亚基因组复制的细胞模型的建立

目的建立一个稳定支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型。方法构建中国人群HCV1b亚型亚基因组复制子质粒,通过体外转录的方法获得亚基因组复制子RNA,采用电穿孔技术把RNA转染到Huh-7.5.1细胞中,经过G418筛选含有HCV1b亚基因组的细胞集落。RT-PCR检测细胞集落中的HCV亚基因组以及Western blot检测细胞集落中的HCV蛋白的表达。用干扰素(IFN)处理含有HCV亚基因组的细胞,观察细胞中HCV RNA的变化。结果G418药物筛选得到了支持HCV1b亚基因组复制的细胞集落。RT-PCR检测有HCVR NANS4B的表达,Western blot检测有HCV的非结构蛋白NS5B的表达。IFN处理含有HCV复制子的细胞,HCV RNA水平明显降低。结论成功建立了支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型,为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究打下了基础。