新型冠状病毒亚基因组RNA检测方法的建立及性能评估

目的建立检测新型冠状病毒(新冠病毒)亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)的方法,并对所建立的方法进行性能评估。方法根据新型冠状病毒sgRNA序列设计引物和探针,建立检测sgRNA的实时荧光逆转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,对所建立的方法进行优化,包括引物、探针的浓度及比例、延伸温度、反应体积和模板量。并对所建立的方法进行性能评估,包括最低检测限、灵敏度、特异性和重复性。对临床样本进行新冠病毒sgRNA和基因组RNA(genomic RNA,gRNA)检测,并对检测结果进行分析。结果建立了检测新冠病毒sgRNA的RT-PCR方法。所建方法的最低检测限为100 copies/mL,对常见病原体的检测结果均为阴性。对高、中、低浓度样本sgRNA进行检测,CV均<5%。115例疑似新冠病毒感染者的咽拭子样本sgRNA为阳性(115/330,阳性率为34.85%)。gRNA-N Ct值<30时,sgRNA-N的阳性率为100.00%;gRNA-N的Ct值介于30~32时,sgRNA-N的阳性率为68.75%;gRNA-N的Ct值介于32~35时,sgRNA-N的阳性率为44.44%;gRNA-N的Ct值>35时,sgRNA-N均为阴性。结论建立了新冠病毒sgRNA的RT-PCR检测方法,方法灵敏、特异、重复性好。

戊型肝炎病毒亚基因组RNA的研究

本文利用同位素代谢标记在HEV感染 8 5～ 1 0 5,6 5～ 7 5h分别检测到 1及 2个亚基因组RNA ,而感染 2 1h后及在成熟的病毒颗粒内未能检测到亚基因组RNA。通过杂交实验 ,发现HEV的亚基因组RNA具有典型的共 3′端的半套式结构 ,且基因组RNA与亚基因组RNA的 5′端不存在共同的引导序列。通过紫外转录图谱发现HEV的亚基因组RNA是通过独立转录的方式产生的。利用引物延伸反应发现两种亚基因组RNA的转录起始位点分别位于RNA聚合酶区及非结构区、结构区的基因间序列。

对烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组RNA生成机制的进一步研究

用原生质体瞬间表达的方法证明，在烟草细胞中ＴＭＶ外壳蛋白亚基因组ＲＮＡ的生成，不是通过核酸酶在基因组ＲＮＡ上直接切割，也不是通过在生成负链ＲＮＡ时预成性终止，再从这种负链ＲＮＡ终止部位起始产生的。ＴＭＶ外壳蛋白亚基因组ＲＮＡ是ＴＭＶ识别利用负链ＲＮＡ中间的亚基因组启动子后产生的。这个启动子位于外壳蛋白读码框５’端２５６碱基范围之内，但大于４８个碱基，虽然ＴＭＶ能利用单链的负链ＲＮＡ上的亚基因组启动子产生正链的亚基因组ＲＮＡ，但从双链的ｄｓＲＮＡ上的负链ＲＮＡ产生亚基因组ＲＮＡ的效率，比从单链负链的ＲＮＡ的效率要高得多。很可能在烟草植株中，ＴＭＶ是通过识别和利用双链复制型ＲＦ或复制中间ＲＩ上的负链ＲＮＡ上的亚基因组启动子直接产生的。

单股正链RNA病毒基因组3'非编码区功能

单股正链RNA病毒数量众多,对人、动物和植物造成很大的危害。病毒基因组3'末端都具有一段非编码区,基因组3'非编码区在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。本文简单介绍了单股正链RNA病毒基因组3'非编码区结构的预测、测定和功能的研究方法,并重点概括了不同单股正链RNA病毒3'非编码区一级序列、茎-环结构、假结体、TLS等结构在病毒基因组的复制、转录和翻译中的调控作用以及目前存在的问题。

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物外壳蛋白基因与3′非编码区的序列分析

The coat protein gene and its 3′ noncoding region of a watermelon isolate of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV-LN) in Liaoning, China was determined and compared with other isolates. The gene encoding the coat protein of CGMMV-LN comprises of 486 nucleotides and encodes a putative protein of 161 amino acids. Sequence comparisons showed that the coat protein of this isolate was identical to that of seven CGMMV isolates infecting cucurbits in Europe and Asia. The 3′ noncoding region of CGMMV-LN consists of 176 nucleotides, which is same as that of CGMMV-KOM, CGMMV-KW and CGMMV–SH.

虫媒黄病毒亚基因组RNA

黄病毒是一大科人类致病性的单股正链RNA病毒。黄病毒包括登革病毒、西尼罗脑炎病毒及日本脑炎病毒等成员,主要径通过节肢动物的叮咬进行传播,即为虫媒黄病毒。研究发现,在虫媒黄病毒复制过程中,除病毒基因组正链RNA、互补的负链RNA及两者的杂合RNA分子外,在病毒感染细胞后还能产生一种病毒亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)。近年对这种sgRNA展开了比较多的研究,结果表明,其产生机制与已知的其他病毒sgRNA产生机制并不相同。该sgRNA的产生与虫媒黄病毒基因组3’非编码区所形成的保守二级结构有关,同时宿主核酸酶对其的不完全降解亦有重要作用。虫媒黄病毒基因组3’非编码区中带有多个与病毒复制相关的RNA元件,而sgRNA的发现有助于全面地认识病毒RNA与宿主RNA代谢途径间的相互作用,为最终阐明病毒的致病机制奠定基础。

新型冠状病毒亚基因组RNA荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立及评价

目的 建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)亚基因组RNA(sgRNAs)荧光重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法。方法 根据SARS-CoV-2的5′-leader和7a、N基因序列设计特异性等温扩增引物和探针,在39℃等温条件下,30 min内对SARS-CoV-2的sgRNAs进行快速检测,并对该方法的灵敏度、特异度及与实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,real time PCR)法的一致性进行评价。结果 该方法检测限可达到20拷贝/μl,且与其他呼吸道病原体均无交叉反应,具有良好的灵敏度和特异度;与荧光定量PCR法相比,2种检测方法一致性较好(κ=0.762,P<0.001)。结论 本文建立的荧光RT-RAA法可用于SARS-CoV-2 sgRNAs的快速检测,对于临床样本感染性的快速诊断有重要意义。

基因Ⅰ型和Ⅲ型日本脑炎病毒sfRNA亚型鉴定及遗传演化分析

旨在探究基因Ⅰ型和Ⅲ型日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染细胞产生的黄病毒亚基因组RNA(subgenomic flaviviral RNA,sfRNA)亚型与演化趋势。应用高分辨率Northern blot检测Ⅰ型和Ⅲ型JEV感染细胞产生sfRNA亚型特征;对美国国立生物技术信息中心(NCBI)收录的99条JEV sfRNA序列通过Mega X软件进行多序列比对及遗传演化分析,用Megalign软件进行核苷酸相似性比较及变异分析。结果表明:Ⅰ型和Ⅲ型JEV感染细胞产生特征相似的4种亚型sfRNA;JEV sfRNA序列10440、10673、10853位核苷酸差异具有基因型特异性(位点说明以JEV HEN0701为例,GenBank:FJ495189.1);Ⅰ型10477位核苷酸的变化相较于Ⅲ型更有利于sfRNA PK1结构的碱基配对;Ⅰ型和Ⅲ型sfRNA组间核苷酸序列相似性为79.2%~100%,Ⅰ型sfRNA组内核苷酸序列相似性为81.6%~100%,Ⅲ型sfRNA组内核苷酸序列相似性为85.6%~100%;Ⅰ型和Ⅲ型sfRNA核苷酸变异以碱基转换为主。本研究发现JEV sfRNA存在一定差异,但同种基因型sfRNA遗传距离接近,结果为揭示JEV基因型差异提供了新思路。

丙型肝炎病毒检测方法的研究进展及其临床意义

丙型肝炎病毒(HCV)为嗜肝性慢性病毒.HCV感染后,患者的起病和临床症状极不典型,以亚临床感染为多见,容易造成漏诊.HCV感染的慢性化发生率明显高于乙型肝炎,较乙型肝炎易早期出现肝硬化、肝癌,死亡率较高.因此HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期诊断和指导临床治疗有重大的意义.目前用于HCV感染诊断的两项主要指标为抗-HCV和HCVRNA,现多采用的第三代检测抗-HCVEIA试剂增加了HCV基因组NS5区表达的蛋白作为抗原,进一步提高了试剂的敏感性,但还存在“窗口期”漏检的问题.HCVRNA检测灵敏度高、特异性强,具有早期诊断的意义,但检出率较低,检测复杂,也可出现假阳性.作为抗-HCV检验的补充试验,HCV核心抗原的检测对处于HCV感染“窗口期”的个体检测有很大价值.

Alu序列与人类疾病研究进展

Alu序列通过RNA依赖性机制即反转录转座在灵长类动物基因组中扩增,其在人类基因 组中的拷贝数已经超过100万个。这些序列在人类基因组中被认为有很多功能,并对基因结构有很大 的影响。Alu序列大概以每200个新生儿就一个插入的速度继续扩增。已有研究表明Alu序列的插入和 Alu重复序列之间的不等同源重组导致了多种人类疾病。Alu序列不仅对基因组的进化做了很大贡献, 而且对大部分人类遗传病也起了很大的作用。随着新的Alu亚类产生,新的亚类引起的疾病又见报道, 本文将对这一方面内容的发展动态进行综述。

动物嵌杯病毒研究简况

一、致病性 已知有几种嵌杯病毒(calicivirus)可引起人与动物的疫病,如猪小泡疹病毒(VESV),猫嵌杯病毒(feline calicivirus,FCV),兔出血病病毒(RHDV),犬嵌杯病毒(canine calicivirus,CCV),Norwalk-Sapporo样病毒(Norwalk-Sapporo like virus)。

科学家首次实现对新冠病毒RNA直接测序

中国科学报3月10日报道,澳大利亚墨尔本大学微生物和免疫学系的Lachlan Coin和Sebastian Duehene团队及合作者,提供了新冠病毒的第一个直接RNA序列,详细介绍了该冠状病毒亚基因组长度的mRNA结构,并描述了从共享数据中揭示的冠状病毒进化遗传学的各个方面。相关论文3月7日发布于预印本服务器bioRxiv(bioRxiv所有论文未经同行评议)。