大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶与tRNA^(Leu)的相互作用 头孢菌素酰化酶的表达、翻译后加工和亚基重组(英文)

第一部分:为得到大量的大肠杆菌tRNALeu1 和tRNALeu2 ,研究tRNA与亮氨酰 tRNA合成酶(LeuRS)的相互作用,用基因克隆的方法高表达并纯化了它们;测定了接受活力和被LeuRS催化的动力学常数;改进了RNA体外转录必需的T7RNA聚合酶的纯化方法,优化了转录条件,转录序列比文献值高 1 0倍.用体外转录方法得到了各种在接受茎突变的tRNALeu变种,研究了一个在CP1结构域插入 40个氨基酸残基的变种LeuRS A对tRNALeu2种等受体的识别,证明了tRNA Leu1 和tRNA Leu2 接受茎上的第一对硷基对是否摆动是LeuRS A识别的关键. 第二部分:在大肠杆菌中高表达头孢菌素酰化酶基因 1 0倍以上.研究了它的α 亚基的N 端变化(LAEP →MGIP )对酶学动力学常数的影响.构建了带有不同抗菌素抗性和启动子的高表达质粒,研究了它们表达的特点,分析了这些质粒的不同用途.用含有编码该酶两个亚基的基因的相容质粒共转化的方法.研究了它们在体内的重组和前体的加工.研究结果表明,该酶可能属于一类新的N

注射用重组人钙调磷酸酶B亚基稳定性的初步研究

目的：对注射用重组人钙调磷酸酶B亚基（rhCNB）的稳定性进行初步研究，以确定其贮藏条件和有效期。方法：采用毛细管区带电泳（CZE），反相高效液相色谱（RP—HPLC），十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）非还原电泳、蛋白质含量测定Bradford法、圆二色谱（CD）、pH值、生物学活性等检测方法，对rhCNB在贮藏温度条件下的稳定性进行了系统研究。结果及结论：3批注射用rhCNB于2℃～8℃贮藏24个月，各项指标：外观、pH值、蛋白含量、纯度、肽图谱、相对分子质量、CD光谱蛋白质二级结构及生物学活性均无明显变化，稳定性好，有效期可暂定为2年。

HPLC和MALDI-TOF-MS法分析重组人钙调磷酸酶B亚基的纯度和肽图谱

用反相高效液相色谱 (RP HPLC)法对重组人钙调磷酸酶B亚基 (rhCNB)的纯度和肽图谱进行了测定 ,以比较不同批次产品的纯度及其一级结构的一致性 ,对其进行质量控制 .并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)法进行验证 .结果表明 ,运用梯度洗脱RP HPLC法能对样品进行纯度检查和肽图谱分析 ,测得 3批样品纯度均达到 98%以上 ,肽图谱能达到批间一致 .同时用MALDI TOF MS法测定 ,纯度结果二者相符 ,质谱肽图经计算机辅助分析 ,确证rhCNB一级结构与天然CNB一致 .证明该方法灵敏、准确、可靠 .

CD和FT-IR法分析重组人钙调磷酸酶B亚基冻干前后与多批产品二级结构的一致性

目的通过测定重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的圆二色谱(CD)和傅立叶变换红外光谱(FT-IR),来研究rhCNB冻干前、后和rhCNB多批产品之间二级结构的一致性,从而确定生产工艺是否稳定,样品是否发生变性等,达到控制产品质量的目的。方法采用CD和FT-IR光谱法分别对3批rhCNB进行蛋白质二级结构测定,并对rhCNB冻干前与冻干后样品进行了CD和FT-IR光谱法二级结构测定。结果与结论CD和FT-IR光谱测得3批样品谱图均达到批间一致,说明样品二级结构稳定,工艺过程较稳定,产品未发生变性。rhCNB冻干前与冻干后2种图谱均无明显变化,说明冻干工艺对rhCNB的二级结构并无改变。

动态浊度法测定注射用重组人钙调磷酸酶B亚基中的细菌内毒素

目的对注射用重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)进行细菌内毒素定量回收试验,建立定量检测其细菌内毒素的方法。方法采用中国药典2000年版附录检测细菌内毒素的动态浊度法。结果注射用rhCNB在20倍稀释后可以消除干扰作用,内毒素回收率在50%～200%范围内,能够进行细菌内毒素定量检测。结论建立的注射用rhCNB细菌内毒素定量检查方法,具有方法简便、快速、准确的优点。

重组钙调磷酸酶B亚基纯化工艺及质量稳定性控制研究

目的在实验室研究的基础上,已进行了表达rhCNB的中试发酵工艺研究和纯化方面的探讨。表达量可达到700mg/L以上,rhCNB纯度可达到95%以上。方法在此基础上进行了以下两方面工作的研究:①为了达到生物制品的质量标准,进一步改进了rhCNB的纯化工艺。②为了能够对rhCNB进行有效的质量稳定控制,该文对制备的3批注射用rhCNB进行了分子结构确证与理化特性鉴定。结果我们表达的重组hCNB与天然hCNB的结构完全一致。使rhCNB有效期保证在2年以上。

重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基在大鼠体内的药动学和组织分布特征

目的研究重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)在大鼠体内的药动学和组织分布特征。方法利用双抗体夹心ELISA法,对组织样本中rhCNB检测的选择性、线性范围、精密度、回收率和稳定性等进行方法学验证。SD大鼠单次iv给予rhCNB 5,10和20 mg·kg^-1,多次iv给予rhCNB 20 mg·kg^-1,于给药前及给药后0.033,0.25,0.5,1,2,4,8和12 h采血,用ELISA法测定rhCNB浓度,用DAS3.0软件计算药动学参数。大鼠单次iv给予rhCNB 10 mg·kg^-1后,分别在0.25,1,2和8 h采集脑、心、肝、脾、肺、肾、全胃、睾丸或卵巢、体脂、骨骼肌、胸腺和血浆,用ELISA测定血浆和组织样品中rhCNB浓度。结果rhCNB 5,10和20 mg·kg^-1单次给药,主要药动学参数为:消除半衰期(t1/2)分别为0.95±0.28,0.85±0.27和(0.91±0.32)h;药时曲线下面积(AUC0-12 h)分别为41.0±4.3,59.5±9.1和(150.6±18.9)mg·h·L^-1;血浆峰浓度(Cmax)分别为44.6±14.4,62.7±15.7和(160.1±27.3)mg·L^-1;在5~20 mg·kg^-1剂量范围内,rhCNB的Cmax和AUC0-12 h比值随着剂量增加而增大。rhCNB多次给药主要药动学参数为:t1/2为(1.16±0.46)h;AUC0-12 h为(94.9±11.0)mg·h·L^-1;Cmax为(121.2±18.9)mg·L^-1。单次给药和多次给药的主要药动学参数无显著性差异。不同组织中rhCNB的分布由高到低的顺序为体脂>肺>肾>脾>睾丸/卵巢>心>肝>胸腺>胃>脑>骨骼肌。结论rhCNB在大鼠体内呈现线性动力学特征,多次给药后大鼠体内无明显蓄积并广泛分布于各个组织。

副猪嗜血杆菌CDT亚基原核表达及其抗原性鉴定

为原核表达副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT毒素并检测其在体外培养时的分泌表达情况,本实验将切除信号肽的CDT毒素的3个亚基基因分别克隆于pET-28a载体中在大肠杆菌进行表达,并将重组蛋白经亲和层析纯化后,免疫兔制备抗血清,用于鉴定H.parasuis体外培养时CDT分泌表达情况。结果表明CDT毒素3个亚基均在Rosetta菌株中得到表达,其中cdtB约为28.2 ku,符合预期大小,而cdtA和cdtC亚基比预期的23.5 ku和17.4 ku略大。表达的3个重组蛋白可以被自然感染猪血清识别,表明其具有良好的反应原性,同时也表明H.parasuis在猪体内定殖或感染过程中分泌CDT。制备的抗血清可以与体外培养H.parasuis的分泌蛋白中的CDT亚基反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,同时也表明H.parasuis体外培养时也分泌CDT。

5种抗原检测囊型包虫病血清学评价

目的评价细粒棘球蚴纯化囊液粗抗原、天然抗原B(nAgB)及其3个重组亚基检测囊型包虫病的效能。方法从新疆源细粒棘球蚴原头节中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码AgB8/1、AgB8/2和AgB8/3基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,IPTG诱导表达分别得到重组蛋白rAgB8/1、rAgB8/2、rAgB8/3;羊细粒棘球蚴囊液经透析沉淀获得纯化囊液粗抗原(HCF)、此纯化囊液粗抗原经煮沸离心弃沉淀得到天然抗原B。用制备的5种抗原分别作为包被抗原,以ELISA法检测囊型包虫病人及其它寄生虫病人和健康人血样中抗体。结果 HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3应用于ELISA法检测囊型包虫病人血清的敏感度依次为90.8%(79/87),87.4%(76/87),67.8%(59/87),78.2%(68/87)和59.8%(52/87);特异度依次为96.0%,96.0%,96.0%,98.0%和97.0%。纯化HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3的诊断效能分别为93.5%,91.9%,82.8%,88.7%和79.6%。纯化HCF和nAgB检测的敏感度高于rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3(P<0.05);rAgB8/2检测的敏感度高于rAgB8/1和rAgB8/3(P<0.05);5种抗原检测的特异度之间均无统计学差异(P>0.05)。结论天然抗原应用ELISA法检测囊型包虫病的效能总体优于重组抗原。

基因工程抗癌新药重组人钙调磷酸酶B亚基对食蟹猴重复给药毒性研究

目的:本研究主要评价食蟹猴静脉多次注射基因工程抗癌新药重组人钙调磷酸酶B亚基(rh CNB)的安全性,为临床设计人用剂量及临床不良反应的监测提供参考依据。方法:将40只健康食蟹猴,随机分为4组:辅料对照组和供试品低、中、高剂量组(给药剂量分别为10,30和90 mg·kg-1),每组10只,雌雄各半,雌性无孕。采用静脉滴注给药途径,每天给药1次,连续给药2周后停药1周,再进行下一周期的给药,共重复给药26周,恢复期8周。试验期间进行各项毒理学指标测定。结果:rh CNB对食蟹猴静脉滴注重复给药观察,免疫原性检测结果显示给药后动物体内出现了特异性免疫反应,呈明显的剂量-效应关系,停药后抗体阳性率明显减少。除上述反应外,不同时间段,各剂量组动物一般症状、体重、摄食量、血液和血生化、外周血和骨髓象、心电图、体温和尿液分析等各项检查均未见与受试物相关的改变。供试品给药剂量组对食蟹猴各重要生命器官结果也未见明显毒性损伤及病理改变。后续进行了免疫原性补充试验,各给药组抗体检测结果为阳性的血清,其中和抗体的检测结果为阴性。说明该供试品所拟定的人日用剂量1~2.7mg·kg-1(60~160 mg·d-1),毒性较小。结论:食蟹猴重复静脉滴注rh CNB 6个月,除了免疫原性检测动物体内出现了特异性免疫反应外,对其余观察指标未见明显影响;试验动物各重要生命器官也无明显毒性损伤及毒性病理改变,NOAEL为90 mg·kg-1。临床使用时应需要关注供试品有可能引起的免疫原性反应。

基因工程抗癌新药重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基在食蟹猴体内的药动学研究

目的:研究重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)单次和多次给药在食蟹猴体内的药动学。方法:按照2.5,5和10 mg·kg^-1剂量给食蟹猴单次静脉注射rhCNB,清洗2周后,10 mg·kg^-1剂量给食蟹猴多次静脉注射rhCNB。分别在9个时间点采血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血药浓度,并用DAS 3.0软件计算药动学参数。结果:rhCNB 3个单次剂量组主要药动学参数:t1/2分别为(0.97±0.20),(1.03±0.10)和(1.03±0.06) h;AUC0~12h分别为(15.66±4.54),(34.30±2.02)和(60.76±6.34)μg·h·mL^-1;rhCNB多次给药主要药动学参数:t1/2为(1.02±0.09) h;AUC0~12h为(56.59±3.13)μg·h·mL^-1。在2.5~10 mg·kg^-1剂量范围内,rhCNB的Cmax和AUC0~12h比值随着剂量增加而成比例增大。单次给药和多次给药的主要药动学参数无显著性差异(P>0.05)。结论:rhCNB在食蟹猴体内呈现线性动力学特征,rhCNB多次给药在食蟹猴体内无明显蓄积现象。

抗癌新药注射用rhCNB的安全药理学研究

目的:通过观察研究注射用rhCNB对小鼠中枢神经系统和食蟹猴心血管和呼吸系统的影响,考察药物可能关系到人的安全性的非期望药理作用,为临床试验提供依据及参考。方法:KM小鼠单次尾静脉给予注射用rhCNB 12,36和108 mg·kg-1,进行小鼠自主活动、平衡协调能力和协同睡眠实验,观察给药后动物的活动情况和行为变化,研究药物对动物中枢神经系统的影响;食蟹猴单次尾静脉给予注射用rhCNB8.2,24.6和73.8 mg·kg-1,采用无创生理信号遥测系统观察清醒食蟹猴的心率、心电、血压、呼吸频率、呼吸幅度和体温,研究药物对动物心血管系统和呼吸系统的影响。结果:KM小鼠单次尾静脉给予注射用rhCNB剂量组动物自主活动、协调运动能力未见明显变化、未见与阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠作用;食蟹猴单次静脉给予注射用rhCNB剂量组动物未见明显剂量或时效相关性的心血管、呼吸系统影响。结论:注射用rhCNB对实验动物的中枢神经系统和心血管系统、呼吸系统均未见明显药物影响。