鼻咽癌细胞亚株不同成瘤与转移潜能的分子机制

背景与目的:我们已从鼻咽癌细胞株SUNE-1的克隆株中筛选出3个具有不同生物学特性的细胞亚株:5-8F(高成瘤、高转移)、6-10B(成瘤、不转移)和13-9B(不成瘤);在本研究中,我们从病毒和遗传两方面探讨鼻咽癌细胞株SUNE-1及其3个亚株的生物学特性差异的分子机制。方法:①PCR检测亚株中EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)的BamHIW片段;②应用原位杂交技术检测SUNE-1及其3个亚株中EBV潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)的表达状况;③应用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)检测SUNE-1及其3个亚株的基因扩增情况。结果:①在SUNE-1及其3个亚株中存在EBVBamHIW片段;②在3个亚株中,都能够检测到EBV-LMP1的表达,且表达强度一致。③CGH检测发现:SUNE-1的DNA拷贝数变呈现以1、2p、3、4、5p、6、7、9、10q、11、12q、13q、17q和18q增加和22q拷贝数减少为主;5-8F染色体变化以3p、7q、8q、9q、和10q拷贝数增加为主;而6-10B和13-9B除少数几个染色体区域发生缺失外,均无DNA拷贝数的增加。结论:鼻咽癌细胞株SUNE-1及其3个亚株,均有EBV的表达和存在不同的染色体变化,提示其生物学特性的差异可能主要由于染色体的变化引起,但EBV的感染对维持鼻咽癌的恶性程度可能起着重要的作用。

联合化疗对膀胱癌细胞株BIU-87及其耐药亚株联合抑制作用的体外实验研究

实验采用微量细胞培养噻唑蓝显色法观察阿霉素 (ADM)、足叶乙甙 (VP- 16 )、丝裂霉素 C(MMC)和羟基喜树碱 (HCPT)等药物联合应用于膀胱癌细胞株 BIU- 87及其耐药亚株 BIU- 87/ A、BIU- 87/ V,结果显示 :HCPT与MMC、 ADM联合应用对亲本及耐药细胞株都能取得较好抑制作用。联合用药能增强化疗药物对 BIU- 87细胞的毒性作用 。

鼻咽癌细胞肝转移亚株的建立

目的建立鼻咽癌细胞肝转移亚株,研究鼻咽癌肝转移机制。方法利用裸鼠体内传代的方法获得肝转移细胞亚株,并用体内和体外实验来观察其侵袭转移能力。结果经体内反复筛选得到肝转移能力高的亚株5-8F-H3B-EGFP,其侵袭性、运动性以及形成肝转移灶的能力均大于母系5-8F-EGFP,并具有较高的肝脏亲和性。结论该亚株的建立为今后研究鼻咽癌肝转移的分子机制奠定了基础。

不同毒力亚株幽门螺杆菌感染在特发性血小板减少性紫癜发病中的意义

目的分析幽门螺杆菌(H.pylori)不同毒力亚株感染与特发性血小板减少性紫癜(ITP)发病的相关性。方法应用免疫印记法检测64例ITP患者和59例对照者的血清H.pylori抗体:细胞毒素相关基因A(CagA)、空泡毒素蛋白A(VacA)、尿素酶A(UreA)、尿素酶B(UreB),并对CagA+和/或VacA+阳性患者随机分组,一组抗H.pylori治疗,另一组、CagA-和VacA-以及H.pylori阴性患者组未作抗H.pylori治疗作为对照组,比较治疗前后血小板计数。结果ITP组患者H.pylori阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);ITP组H.pylori阳性患者CagA+和/或VacA+型者所占比例高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。CagA+和/或VacA+阳性患者经H.pylori根治后血小板计数较CagA+和/或VacA+阳性未根治组升高明显,P<0.05有统计学意义。结论ITP患者幽门螺杆菌的感染率高,而且不同毒力亚株感染与其发病相关。

口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析

应用RT PCR和nPCR实现了口蹄疫病毒O/PanAsia/10株的全衣壳基因的克隆和序列测定.对核苷酸和氨基酸的序列分析表明,与经典O型毒株比较存在较大变异.其中4种结构蛋白的变异顺序是VP1>VP3>VP2>VP4.P1基因G+C值约55%.全衣壳蛋白相对分子质量约8 0×104.主要结构蛋白VP1呈碱性,等电点约9 5.

全反式维甲酸提高人结肠癌细胞亚株SW480/M5对奥沙利铂敏感性

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoicacid,ATRA)提高人结肠癌细胞亚株SW480/M5对奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)敏感性的可能机制。方法 MTT法筛选ATRA和L-OHP实验浓度。流式细胞仪检测ATRA对肿瘤细胞周期影响。分别用ATRA、L-OHP、ATRA联合L-OHP作用SW480/M5细胞,MTT法检测药物对肿瘤细胞抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期及凋亡率,原子光谱吸收仪检测肿瘤细胞DNA含铂(Pt)量。结果 L-OHP抑制SW480/M5细胞增殖的GI50为58.0mg/L,主要阻滞肿瘤细胞在S和G2/M期。ATRA8.0μmol/L作用24小时后,G1期细胞减少,S期细胞增多;作用72小时后,S期和G2/M期细胞增加并明显抑制肿瘤细胞增殖。8.0μmol/LATRA作用至48小时后联合L-OHP,两药联合由相加作用转变为协同作用;联合用药后S期和G2/M期细胞明显增多,细胞DNA含Pt量显著增加,呈时效依赖性。相对于单独用药,联合用药并不上调肿瘤细胞凋亡率。结论 ATRA通过改变SW480/M5细胞周期和提高细胞DNA含Pt量,明显增加肿瘤细胞对L-OHP敏感性。

泛亚株流行理论与世界口蹄疫的形势

最近15年对口蹄疫病毒(FMDV)的分子流行病学研究取得了较大进展.主要是基于对病毒主要结构蛋白VP1基因进行的反转录(RT)-PCR扩增和核苷酸测序,个别的进行了全基因的研究.其内容包括:①在欧洲对与使用疫苗毒株密切相关的疫情暴发进行分子流行病学研究;②国际上对FMDV许多基因进化关系的比较和疫原追踪,世界口蹄疫咨询实验室(WRL)据此建立起有地缘关系的FMDV拓扑分型;③对单个流行毒株的详细研究,建立了泛亚株(PanAsia)流行理论,认为该毒株是当今世界口蹄疫的优势毒株[1].最近对泛亚株衣壳基因区以外的基因变异引起疫病暴发的关系进行了研究,结果显示这些区域的基因并非血清型特异的,对追踪疫情是否有用尚不得而知.不过对非结构区域基因的研究,有助于弄清FMDV型内和型间基因组合的频率和流行病学意义[2].

汉族人肾透明细胞癌肺转移小鼠模型的建立及肺转移细胞亚株的筛选

目的:建立可稳定传代的肾透明细胞癌小鼠肺转移模型,并在此基础上初步筛选出肾透明细胞癌特异性鼠肺转移细胞亚株,为后续研究奠定基础。方法:选用本实验室前期建立的肾透明细胞癌细胞株RCC05-TXJ,体外扩增培养制成细胞悬液后注射于NOD-SCID小鼠颈背部皮下,成瘤后取出瘤组织接种于另外NOD-SCID小鼠的肾包膜下,待有肉眼可见瘤块后,处死小鼠并取出肿瘤组织接种于新NOD-SCID小鼠的肾包膜下,反复数轮,直至出现稳定的鼠肺转移模型。此时取模型鼠肺转移组织,一部分继续接种于新鼠肾包膜下,反复数轮,尝试以转移组织诱导肺转移;另一部分进行原代培养,细胞经体外扩增纯化后制成悬液接种于新鼠肾包膜,数轮循环至产生肺转移,筛选能产生稳定鼠肺转移的细胞亚株。整个筛选过程均观察记录原位成瘤、淋巴及肺转移形成情况,并对肿瘤组织进行病理组织学观察及CA9(肾癌标志)、CD133(干细胞标志)表达检测。结果:以RCC05-TXJ细胞株接种所致NOD-SCID小鼠颈背部皮下肿瘤组织作为移植瘤材接种鼠肾包膜在第2轮即出现鼠肺转移,此后3～6轮以鼠肺转移组织移植肾包膜下,均能成功诱导转移。以鼠肺转移组织原代培养RCC细胞均获成功,第6轮原代培养细胞扩增纯化后制成的细胞悬液(RCC05-TXJ-L)接种于鼠肾包膜下,出现特异性肺转移,重复2轮实验结果稳定。RCC05-TXJ-L细胞具有生长速度快(传代时间约为2d)、原位成瘤时间短(1周左右)、接种后转移性较强、CA9及CD133表达升高等特点。结论:RCC05-TXJ在NOD-SCID小鼠体内多轮反复筛选可建立稳定的肾细胞癌鼠肺转移动物模型;在此基础上筛选出的肺转移性细胞亚株RCC05-TXJ-L可稳定诱导NOD-SCID鼠产生肺部转移。

采用反复照射方法建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株

目的为成功建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株,并探讨鼻咽癌放射抗拒机理。方法采用类似临床放疗的照射模式反复照射从人鼻咽癌细胞系CNE-3中分离出具有放射抗拒性的新细胞系亚株。结果采用类似临床放疗的照射模式反复照射分离出具有放射抗拒性的新细胞系亚株CNE-3R,,其在传代3个月后仍表现出较稳定的放射抗拒性,其SF2值均>0.5。结论采用该研究方法能成功建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株,为研究鼻咽癌放射抗拒机理提供了必要的工具。

口蹄疫病毒泛亚株衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和鉴定

以pT-P1质粒为模板,应用引物对P1-S2/P1-A2进行PCR扩增,获得口蹄疫病毒（FMDV）泛亚株全衣壳前体基因（P1）片段.用EcoRI 酶切并连接将P1克隆入表达载体pSOC中,以引物对Pr.78/P1-A2进行PCR扩增,鉴定P1基因插入方向正确.在大肠杆菌中以P1-SOC融合蛋白（约98ku）的形式获得高效表达（21%）.在0.5～3 mmol/L IPTG诱导浓度和37 ℃220 r/m振摇培养1～4 h条件下表达量保持稳定.表达产物经T4-3C蛋白酶作用,裂解后可产生多种蛋白.出现与抗口蹄疫血清反应的蛋白条带.

全反式维甲酸对人结肠癌细胞亚株SW480／M5增殖和凋亡的影响

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对人结肠癌细胞亚株SW480／M5增殖和凋亡的影响。方法噻唑蓝（MTT）比色法检测1、2、4、8μmoL／LATRA作用24、48、72h对SW480／M5细胞的抑制率。流式细胞仪检测8μmoL／LATRA作用24、48、72h及2、4μmoL／LATRA作用48h的肿瘤细胞周期和凋亡率。结果ATRA抑制SW480／M5细胞增殖作用呈一定时效和量效依赖性；8μmoL／LATRA作用72h明显抑制肿瘤细胞增殖，抑制率接近30％。2、4μmoL／LATRA作用SW480／M5细胞48h或8μmoL／L作用24h，肿瘤细胞G，期比例开始降低，S期比例增加（P〈0．05）。8μmoL／LATRA作用48h后，S期比例进一步增高，G2／M期细胞比例不增加；作用72h后，G，期细胞比例进一步下降，伴G2／M期细胞比例增加（P〈0．05）。8μmoL／LATRA作用24h无明显诱导SW480／M5细胞凋亡作用，作用48h或72h可诱导肿瘤细胞凋亡，但凋亡率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论8μmol／LATRA作用48h或72h通过阻滞SW480／M5细胞在S期或（和G2／M）期，并诱导肿瘤细胞凋亡，可明显抑制肿瘤细胞增殖。

国内外卡介菌亚株抗生素敏感特性分析

目的分析国内外不同卡介菌亚株的抗生素敏感特性。方法对国内外不同卡介菌亚株采用比例法进行一线抗结核药物[异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、链霉素(streptomycin,SM)及乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]、二线抗结核药物[左旋氧氟沙星(levofloxacin,LFX)、丁胺卡那霉素(amikacin,AK)、卷曲霉素(capreomycin,CPM)、乙硫异烟胺(ethionamide,TH)及对氨基水杨酸(p-aminosalicylic acid,PAS)]敏感性分析,采用BACTEC MGIT960培养系统进行一线抗结核药物及吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)抗生素敏感性分析。结果经比例法分析,不同卡介菌亚株均对一线抗结核药物敏感,除对TH耐药外,对其他二线抗结核药物均敏感;经BACTEC MGIT960系统分析,不同卡介菌亚株对RFP、SM、EMB均敏感,对PZA均耐药;卡介菌亚株BCG Pasteur 1173及BCG Tokyo172对INH敏感,而BCG Danish 1331菌株及中国卡介菌菌种BCG D2 PB302、BCG NIFDC 945 SⅢ均对INH耐药。结论中国生产用卡介菌菌种BCG D2 PB302及BCG NIFDC 945 SⅢ在抗生素敏感性方面与BCG Danish1331菌株一致,与其他亚株有差异。

裸鼠人肾癌SOI模型的建立及高转移亚株的筛选

目的 建立人肾癌裸鼠转移模型 ,并分离肺转移亚株。 方法 用自建肾癌细胞系RCC 9863建立裸鼠SOI(surgicalorthotopicimplantation)模型。从裸鼠皮下移植瘤中取组织块 ,手术包埋于裸鼠左肾实质内。取肺结节 ,组织块法体外培养。癌细胞行左肾细胞悬液原位接种 ,重复 1次 ,克隆筛选肺转移亚株。 结果 15d左右裸鼠左肾区可触及包块 ,质硬 ,有结节。 5 5d裸鼠出现恶液质。SOI模型肿瘤生长快 ,呈浸润性 ,肺脏、淋巴结、肝脏可见转移灶。转移株细胞增殖周期短 ,软琼脂集落形成率高 ,裸鼠皮下接种后 ,成瘤潜伏期短 ,瘤体大 ,并可以形成广泛肺转移。获得的高转移株命名为MRCC ,其Ⅳ型胶原酶呈强阳性 ,增殖细胞核抗原 (PCNA)高表达 ,nm 2 3表达率与RCC 9863差别无显著性意义。 结论 肾癌SOI模型的建立并筛选出一株肺脏高转移性细胞亚株 。

不同转移特性稳定表达绿色荧光蛋白的乳腺癌MCF7细胞亚株的建立

目的建立不同转移特性并稳定表达绿色荧光蛋白的人乳腺癌MCF7细胞亚株。方法转染绿色荧光蛋白（GFP）人MCF7细胞，通过有限稀释法得到10株亚株，细胞电泳得到电泳率最高（A2）、最低（c6）的两株，测定其增殖率、克隆形成率、体外侵袭能力，行裸鼠皮下、原位成瘤试验。结果获得稳定表达绿色荧光蛋白不同转移特性的细胞亚株A2和c6，A2的群体倍增时间为25．6h，C6为41．8h；软琼脂形成率A2为30．7％，C6为14％；体外侵袭能力，A2的平均侵袭细胞数为（136．80±12．36）个，明显高于C6（73．62±9．76）个；裸小鼠皮下成瘤试验发现A2成瘤力强，并且A2原位接种后可出现骨转移。结论建立的细胞亚株有不同转移特性，有助于进一步研究乳腺癌骨转移的分子机制和治疗。

O型口蹄疫泛亚毒株单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的O型口蹄疫泛亚毒株免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA筛选,获得了ⅢA11、ⅢC3和ⅢF10 3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过间接ELISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1:160～1:640,腹水为1:5×104～1:4×105;经ELISA法测定,3株单克隆抗体均与泛亚株VP1蛋白反应,而不与A型口蹄疫病毒VP1蛋白反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅢA11和ⅢF10分泌的抗体为IgG1亚类,ⅢC3分泌的抗体为IgG2b亚类.单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,ⅢA11与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而ⅢC3和ⅢF10的识别位点相近.

陆地棉亚红株突变的质量遗传规律研究

分析了陆地棉亚红株突变体的淡红叶性状与当日红花性状的质量遗传规律,结果显示,淡红叶性状是受一对不完全显性基因控制的质量性状。连锁分析表明:淡红叶性状与当日红花性状完全连锁,是受同一对显性基因控制的质量性状;淡红叶与棕絮性状符合两对性状完全独立分离规律,不存在连锁遗传关系。等位性测定显示,淡红叶性状与经典红叶性状杂交后代,符合两对显性基因控制的独立分离理论比例,表明控制亚红株突变的基因与控制经典红叶的R1基因不在同一基因位点。根据以上试验结果,推定陆地棉亚红株突变是一个新的质量突变性状,暂将它的基因符号定为RS。

陆地棉亚红株突变性状的连锁遗传规律分析

以具有绿叶、花瓣红心的陆地棉、海岛棉与具有亚红株、无红心的陆地棉种质为试验材料,通过经典遗传学的二点测验分析了亚红株突变的连锁遗传规律;结果显示,测交群体(E083×B026)×苏9701、(B026×E083)×苏9701的平均交换值为1.35%;测交群体(E083×海7124)×苏9701、(海7124×E083)×苏9701的平均交换值为2.94%。同时,用亚红株、无红心、棕絮与绿叶、红心、白絮种质杂交,进行三点测验,结果表明:基因Rs在Lc1、R2之间;基因Rs和Lc1的遗传距离为42.21cM,Rs和R2的遗传距离为1.68cM。当两对基因同时发生双交换时,相互干扰小,符合系数达0.79。根据已知的基因遗传距离,整合后绘制了遗传连锁图:Rs基因位于基因R2、Lc1以及分子标记NAU2863、NAU3735和NAU1048、BNL2634之间;其中Rs基因两侧的分子标记NAU3735和NAU1048与它的遗传距离分别为0.1cM和0.2cM。

陆地棉亚红株突变体的研究进展及育种应用前景

介绍了一个新的陆地棉色素突变体,即亚红株突变体,对该突变体的发现、遗传分析及分子标记研究进展进行了综述。分析了其与已在陆地棉中鉴定出与红色素沉着有关的3个基因位点R1、R2和Rd之间的关系,并提出了此突变体在育种上的应用前景,尤其是其性状在提高光合效能上的优势,为棉花实现高光效育种提供了一条途径,对棉花高产育种具有重要意义。