植物乳杆菌共轭亚油酸异构酶基因的克隆、序列分析及重组表达

利用MRS培养基培养植物乳杆菌AS1.555,收集菌体后提取总DNA,用PCR技术扩增其亚油酸异构酶基因,克隆到pQE30质粒载体上,并进行测序。测序结果表明,扩增DNA全长1710 bp,编码569个氨基酸,分子量为64.7 ku。经同源性比较,此核酸序列与罗伊氏乳杆菌、短双歧杆菌、疮疱丙酸杆菌亚油酸异构酶基因核苷酸序列差别较大,推测此基因的来源与上述菌种不同。

植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因的乳酸克鲁维酵母工程菌的构建

试验旨在构建表达植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因的酵母工程菌。以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板,通过PCR扩增亚油酸异构酶基因后,与乳酸克鲁维酵母的表达载体p KLAC1相连;重组质粒电转化至乳酸克鲁维酵母菌CICC1777,经菌落PCR和序列分析进行阳性克隆的鉴定。结果表明,成功构建植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因酵母表达载体和实现在乳酸克鲁维酵母菌的转化。这是首次将P-8亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中获得表达,为酵母体外表达蛋白研究以及构建高产CLA基因工程菌株和大规模应用在食品工业生产中奠定基础。

植物乳杆菌亚油酸异构酶多肽基因的克隆

利用分子生物学方法对植物乳杆菌P8的亚油酸异构酶多肽基因进行克隆。培养菌体后提取总DNA,针对亚油酸异构酶的某一结构域设计一对特异性引物,PCR扩增该结构域多肽片段基因,再将其克隆到pEASY-E1原核载体上,转化到大肠杆菌BL21中。通过菌落PCR和序列分析鉴定,表明获得了亚油酸异构酶多肽片段基因的克隆。

疱疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因转化亚麻芥

亚油酸异构酶可特异性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体。本研究采用PCR技术从疱疮丙酸杆菌GIM1.243中扩增出亚油酸异构酶基因PAI,片段长1275bp。按照目标宿主亚麻芥的密码子偏好性对该基因部分序列进行优化,命名为CaPAI。借助双T-DNA表达载体pSB130,用菜豆种子特异性启动子PhaP替换原有的CaMV35S启动子,驱动CaPAI,终止子替换成菜豆的终止子PhaT;另一个T-DNA保留其原有的表达框,其中含有潮霉素筛选标记基因。通过农杆菌介导的FloraDip转化法,将构建好的高效植物表达载体pSB130-PhaP-CaPAI-PhaT转入亚麻芥中,抗性筛选和PCR鉴定显示CaPAI基因已整合进亚麻芥基因组中。

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的菌株,对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原(myosin-cross-reactive antigen,MCRA)基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆,克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带,说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因,构建重组菌突变体库,利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株,其中p Cold-ycmcra-gfp重组菌243株,吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4,提高了5.02倍;p Cold-yclai-p-gfp重组菌156株,产量最高的为39号菌(11.62±0.003 6)μg/m L,提高了2.99倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因,并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。