植物乳杆菌亚油酸异构酶多肽基因的克隆

利用分子生物学方法对植物乳杆菌P8的亚油酸异构酶多肽基因进行克隆。培养菌体后提取总DNA,针对亚油酸异构酶的某一结构域设计一对特异性引物,PCR扩增该结构域多肽片段基因,再将其克隆到pEASY-E1原核载体上,转化到大肠杆菌BL21中。通过菌落PCR和序列分析鉴定,表明获得了亚油酸异构酶多肽片段基因的克隆。

植物乳杆菌共轭亚油酸异构酶基因的克隆、序列分析及重组表达

利用MRS培养基培养植物乳杆菌AS1.555,收集菌体后提取总DNA,用PCR技术扩增其亚油酸异构酶基因,克隆到pQE30质粒载体上,并进行测序。测序结果表明,扩增DNA全长1710 bp,编码569个氨基酸,分子量为64.7 ku。经同源性比较,此核酸序列与罗伊氏乳杆菌、短双歧杆菌、疮疱丙酸杆菌亚油酸异构酶基因核苷酸序列差别较大,推测此基因的来源与上述菌种不同。

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast，找到一个同源编码框，参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物，利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因，并克隆到pQE30质粒栽体上进行测序，分析测序结果表明，扩增得到的目的DNA全长1776bp，G＋C含量为37.5％，共编码591个氨基酸，理论相对分子质量67.5kDa．用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析，结果表明，第20～40位氨基酸有较强的疏水性。不过，N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高，最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间，但预测其被切割的可能性概率低于1％。可以推断，在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列。

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2+金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的基因表达调控机制分析

对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的启动子区进行了定位,证明该基因为单顺反子结构。分析该酶的代谢途径证明亚油酸异构酶单独处于一条分支途径,无其他的酶与之协同作用。分析四种乳酸菌亚油酸异构酶基因的上游调控区,发现了12个保守位点,可能在亚油酸诱导基因表达调控中起重要作用。确定该蛋白N端无信号肽存在,但在N端25(27)～42位存在跨膜区,取向略微倾向于由外向内。证明嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的密码子偏好性与大肠杆菌的存在一定差异,可能影响亚油酸异构酶基因的表达,并提出了改造方案。

植物乳杆菌亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达和功能鉴定

应用基因重组表达技术将一个推定的植物乳杆菌亚油酸异构酶基因(pli18)克隆到pET-30a载体的T7启动子的下游,构建pET30-pli原核表达载体。经IPTG诱导和低温培养20h后,在其宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表达了可溶性的PLI18重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化和酶反应产物的气相色谱检测表明,PLI18重组蛋白具有亚油酸异构酶活性,从而证明pli18基因为1个新的亚油酸异构酶基因。为亚油酸异构酶的进一步研究及其在农产品加工中的应用打下了基础。

植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因的乳酸克鲁维酵母工程菌的构建

试验旨在构建表达植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因的酵母工程菌。以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板,通过PCR扩增亚油酸异构酶基因后,与乳酸克鲁维酵母的表达载体p KLAC1相连;重组质粒电转化至乳酸克鲁维酵母菌CICC1777,经菌落PCR和序列分析进行阳性克隆的鉴定。结果表明,成功构建植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因酵母表达载体和实现在乳酸克鲁维酵母菌的转化。这是首次将P-8亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中获得表达,为酵母体外表达蛋白研究以及构建高产CLA基因工程菌株和大规模应用在食品工业生产中奠定基础。

嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及其pMG36e表达载体的构建

以嗜酸乳杆菌基因组为模板,对亚油酸异构酶基因进行PCR,PCR产物克隆到pMD-19T质粒中,经菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定克隆成功后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建乳酸菌表达载体pMG36e-LAI并转化到大肠杆菌DH5α中,经菌落PCR和酶切分析初步证明表达载体pMG36e-LAI构建成功。该研究为利用工程菌工业化生产高产量、高活性亚油酸异构酶制剂来生产CLA奠定基础。

微生物共轭亚油酸异构酶的生物学研究

在各种共轭亚油酸异构体中,c9,t11-18∶2和t10,c12-18∶2这两种天然不饱和脂肪酸异构体被认为具有生物活性,如抗癌、抗动脉粥样硬化、减肥、促进生长、缓和免疫反应副作用等,因而在医药、食品、保健品、化妆品等领域有着广阔的应用前景.一些微生物能产生共轭亚油酸异构酶(Conjugated linoleic acid isomerase,EC 5.2.1.5),该酶又能专一性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体的反应,因此近几年来倍受关注,利用生物合成法生产共轭亚油酸已成为该领域未来的发展趋势.然而目前,共轭亚油酸异构酶的物种分布及进化关系、在细胞中的生物学功能、结构域、催化反应机理等尚未得到完整的阐释,利用基因工程技术大量高效地表达有活性的重组酶也尚未得到很好的解决.本文在前人对共轭亚油酸异构酶进行的多方面研究的基础上,对近年来共轭亚油酸异构酶的分布、生物学作用、酶的催化反应机理、酶基因的克隆表达等生物学方面的研究进展进行了综述,并利用生物信息学方法对已知的共轭亚油酸异构酶序列进行了初步分析.

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的菌株,对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原(myosin-cross-reactive antigen,MCRA)基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆,克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带,说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因,构建重组菌突变体库,利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株,其中p Cold-ycmcra-gfp重组菌243株,吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4,提高了5.02倍;p Cold-yclai-p-gfp重组菌156株,产量最高的为39号菌(11.62±0.003 6)μg/m L,提高了2.99倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因,并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。

优化乳杆菌高产共轭亚油酸的研究进展

共轭亚油酸(CLA)是亚油酸(LA)的一组位置和空间异构体的总称,其中具有生理活性的异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA,它们具有丰富的营养价值和医药价值。在乳球菌属和链球菌属等乳酸菌、丙酸杆菌、瘤胃细菌以及其它菌属中,分离纯化得到的亚油酸异构酶,可催化LA异构化为CLA,利用酶法合成CLA可以有效弥补传统化学合成法的缺陷。本文概述了近年来国内外利用紫外、微波、等离子体诱变、离子注入等物理或化学方法诱变、改造亚油酸异构酶,优化产酶条件和酶学特性,还阐述利用定点突变、基因敲除等基因工程方法,对生产菌株进行改造和培养条件优化,提高CLA产量的相关研究,为进一步筛选出高产共轭亚油酸菌株和CLA的产业化应用提供理论依据。

植物乳杆菌lai基因同源重组敲除载体的构建与鉴定

植物乳杆菌中lai基因编码亚油酸异构酶可催化亚油酸转化生成共轭亚油酸,为了进一步研究lai基因的功能,利用同源重组基因敲除技术,成功构建用于敲除植物乳杆菌lai基因的同源重组敲除载体。这不仅为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定基础。

疱疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因转化亚麻芥

亚油酸异构酶可特异性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体。本研究采用PCR技术从疱疮丙酸杆菌GIM1.243中扩增出亚油酸异构酶基因PAI,片段长1275bp。按照目标宿主亚麻芥的密码子偏好性对该基因部分序列进行优化,命名为CaPAI。借助双T-DNA表达载体pSB130,用菜豆种子特异性启动子PhaP替换原有的CaMV35S启动子,驱动CaPAI,终止子替换成菜豆的终止子PhaT;另一个T-DNA保留其原有的表达框,其中含有潮霉素筛选标记基因。通过农杆菌介导的FloraDip转化法,将构建好的高效植物表达载体pSB130-PhaP-CaPAI-PhaT转入亚麻芥中,抗性筛选和PCR鉴定显示CaPAI基因已整合进亚麻芥基因组中。