亚洲韧皮杆菌在单株脐橙病树的分布情况

【目的】研究亚洲韧皮杆菌(CLas)在纽荷尔脐橙病树的分布情况,为柑橘黄龙病(HLB)的防控提供参考依据。【方法】以1~3个枝条表现斑驳黄化叶片症状的纽荷尔脐橙病树为研究对象,对主干发出的5个主枝(A、B、C为斑驳黄化枝条,D、E为无症状枝条)的叶片分别取样,运用PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测,用2^(-ΔΔCr)法分析树体各部分黄龙病菌含量。对于果树上表现典型HLB病果但叶片无症状的结果枝,分别检测典型病果和相应叶片的感病情况。【结果】PCR对A、B、C、D、E的阳性检出率分别为88.57%、61.11%、54.17%、6.67%和0,qPCR对A、B、C的阳性检出率均为100.00%,对D、E的阳性检出率分别为40.00%和13.33%;2^(-ΔΔCr)法分析发现,斑驳黄化叶片中病原菌含量更高,病果的阳性检出率高于相应的无症状叶片样品。【结论】CLas在表现典型斑驳黄化症状的叶片和果实中的含量及阳性检出率均较高,病原菌在病树中分布不均匀。在进行HLB检测时,应选取典型或疑似症状样品,并运用qPCR进行检测,一旦发现树体局部发病,应当整株销毁。

柑橘黄龙病菌效应子致病机制研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是全世界范围内为害最严重的柑橘病害之一,每年对柑橘生产造成巨大损失,严重影响全球柑橘产业发展。在中国岭南地区,重要药用植物茶枝柑、化州柚、广佛手等均受到柑橘黄龙病的威胁。亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)是最常见的柑橘黄龙病致病菌株,该菌定殖于植物的韧皮部,主要感染芸香科柑橘属(CitrusL.)植物。目前尚无体外成功培养亚洲韧皮部杆菌的报道,因此对柑橘黄龙病致病机制研究和黄龙病防治均有较高难度。效应子(又称效应蛋白)是病原菌向宿主分泌的一类致病因子,是病原菌侵染植物的重要武器。效应子能够靶向宿主细胞关键免疫信号转导和调控组分,从而抑制植物防御反应,增强病原菌致病性。柑橘黄龙病菌能够分泌近百个效应子,根据分泌途径的不同,主要分为Sec依赖型效应子和非经典分泌效应子,其中Sec依赖型效应子有90个、非经典分泌效应子有15个。这些效应子在柑橘黄龙病菌侵染宿主过程中发挥关键作用。已有研究发现,黄龙病菌效应子能够靶向包括植物免疫信号转导、细胞自噬、水杨酸信号途径等多个生物学过程,从而干扰宿主柑橘的防御反应,以促进黄龙病菌的定殖。该文结合近年来有关柑橘黄龙病菌效应子致病机制的研究,阐述了柑橘黄龙病研究概况、黄龙病菌效应子的分类,重点综述了影响柑橘防御反应的柑橘黄龙病菌效应子的致病机制,最后展望了黄龙病菌效应子的未来研究趋势和方向,讨论了基于效应子靶标寻找黄龙病重要抗性基因的可能性,期望通过亚洲韧皮部杆菌效应子研究,为柑橘黄龙病致病机制研究和病害防控提供指导。

广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析

【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病(Huanglongbing,HLB)危害情况及黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度(2020和2021年)的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变(14.29%)外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高(52.94%)。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同(14.29%)。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样品CLas检出率最高(61.64%),其次是均匀黄化型(24.00%)和褪绿斑驳型(20.00%),无症状样品的CLas检出率亦高达11.54%,均较2020年的检出率增加。通过对CLas基因组高变区的PCR产物进行测序,发现CLas菌株存在丰富的遗传多样性,37株CLas菌株可聚为7个类群,与寄主柑橘的种类有一定关系,但其与症状类型及地理来源无明显的相关性。【结论】不同年份、地理来源、柑橘种类和症状类型的CLas检出率差异较大,且发病率有逐年上升趋势。田间缺素黄化型植株确诊为感染黄龙病的概率最大,其次是均匀黄化型和褪绿斑驳型,无症状植株也有很大概率感染黄龙病。CLas菌株存在丰富的遗传多样性,与寄主柑橘的种类有一定关系,但与症状类型及地理来源无明显的相关性。

柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017-2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%-83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。

马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析

【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。【方法】以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。【结果】症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。【结论】马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。

柑橘SAR及其信号转导基因CsSABP2在黄龙病菌侵染中的响应特征

【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。【目的】以柑橘HLB不同耐病品种为材料,研究柑橘SAR及其信号转导的关键酶基因CsSABP2(salicylic acid binding protein 2)在HLB病原菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(CLas)侵染中的响应特征,了解柑橘SAR及CsSABP2响应CLas侵染的作用。【方法】从SAR Marker基因CsPR1、CsPR2、CsPR5表达、活性氧H_(2)O_(2)水平和淀粉含量变化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA调控柑橘SAR的特征。进一步,基于易感HLB锦橙(Citrus sinensis)和耐HLB酸柚(C.grandis)感染CLas转录组测序比较分析,筛选和克隆响应CLas侵染的CsSABP2差异表达基因;生物信息学分析预测差异基因的生物学功能;qRT-PCR分析差异表达基因在锦橙、酸柚和耐HLB马蜂柑(C.hystrix)中响应CLas感染的表达变化;以锦橙叶片为试材分析差异表达基因响应外源SA和MeSA诱导的表达特征。【结果】SAR Marker基因响应CLas表达分析表明,CsPR1、CsPR2和CsPR5均正向响应CLas侵染上调表达,CsPR2和CsPR5在酸柚和马蜂柑中表达水平高于锦橙,特别是叶肉中两个基因的表达水平均显著高于锦橙;相反,CsPR1在叶脉中上调表达水平明显高于叶肉,且在锦橙叶脉中表达水平显著高于酸柚和马蜂柑叶脉中。离体模拟SA和MeSA调控柑橘SAR反应显示,与SA处理相比,MeSA处理明显诱导CsPR1、CsPR2和CsPR5上调表达,同时非处理部位基因(特别是CsPR5)表达水平也明显上调。H_(2)O_(2)检测结果表明,外源MeSA诱导非处理部位H_(2)O_(2)积累显著强于SA。同时,通过对外施MeSA、SA的感病叶片进行连续5周的淀粉含量检测,发现MeSA能明显减少感病叶片中淀粉的积累。进一步转录组数据和生物信息学分析表明,4个SAR关键调控基因CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-3、CsSABP2-4显著响应CLas侵染而差异表达,且编码蛋白质均含SABP2水解活性必需的保守结构域。qRT-PCR结果表明,CsSABP2-1、CsSABP2-4在耐病品种酸柚和马蜂柑中受CLas诱导高水平表达且在叶脉中的表达水平高于叶肉;CsSABP2-2和CsSABP2-3表达水平变化不明显。激素诱导结果显示,CsSABP2主要响应MeSA的诱导表达,MeSA显著诱导CsSABP2-2高水平表达(>10倍),且显著下调CsSABP2-1和CsSABP2-4的表达(下调至0 h表达量的15%—55%)。【结论】耐病品种酸柚和马蜂柑SAR响应CLas的反应明显强于易感病品种锦橙,且MeSA在介导柑橘SAR抗病反应中起正向调控作用。SA与MeSA信号转导的关键酶基因CsSABP2-1和CsSABP2-4在柑橘SAR响应CLas侵染中起着重要作用,其高水平表达与柑橘HLB抗性紧密相关;而且CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-4在调控SAR应答柑橘CLas侵染中可能起着关键的协同作用。

江西省吉水县柑桔黄龙病菌检测

为了确切诊断江西省吉安市吉水县近年出现的疑似柑桔黄龙病,2019年12月从该县6个柑桔园中共采集12份(株)叶片样品,采用PCR和序列测定技术对叶样进行黄龙病菌检测。结果,从6份样品中检测到柑桔黄龙病菌亚洲种,即亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)。表明吉水县已有柑桔黄龙病发生。

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

【背景】在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱(Diaphorina citri)体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘(Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju)的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘,分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d,利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群,分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周,移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量,每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度,利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异,但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常,出现均匀黄化、小叶的明显症状,而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现,在叶片病菌浓度相近的情况下,相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片,接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩,在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖,且达到较高的病菌浓度,间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状,而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状,Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况,说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

黄龙病菌在柑橘果实橘络中的分布

黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)可在柑橘果实橘络中大量增殖。为探究其在染病柑橘果实橘络内的增殖与分布规律,以感染黄龙病的沃柑、脐橙、琯溪蜜柚和沙田柚果实为材料,利用RT-qPCR对果实橘络单位片段(每1.5cm长片段)组织中的CLas含量进行定量分析,同时对感染黄龙病的沃柑和脐橙同一果实橘络不同位置片段中的CLas含量进行定量分析。结果表明,4个品种橘络中的CLas数量存在差异,其中沃柑和琯溪蜜柚橘络平均每1.5 cm片段中的CLas数量显著高于脐橙和沙田柚(P<0.05)。沃柑和脐橙果实同一橘络位于中端或中后端片段组织中的平均CLas显著高于前端(P<0.05),而琯溪蜜柚和沙田柚各部位无差异。CLas在不同品种果实橘络中的丰度差异可能与不同品种橘络中的物质组成有关,而CLas更倾向于在果实橘络中端或中后端组织中增殖的原因可能与营养物质在橘络中的分布有关。

柑橘黄龙病菌内参基因的筛选与评估

【背景】柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,主要由候选韧皮部杆菌属亚洲种("Candidatus Liberibacter asiaticus",CLas)引起。CLas全基因组测序已经完成,因而该病原菌的基因表达研究和功能验证得以进行。【目的】筛选CLas内参基因并评估其不同侵染时期和在不同品种植物寄主中的表达稳定性。【方法】基于基因功能类别,利用实时荧光定量PCR技术分析23个CLas的候选内参基因相对表达情况(16Sr RNA基因作为参照基因)。结合Ct值标准差和geNorm、NormFinder、RefFinder软件,评价内参基因的表达稳定性。【结果】在感染黄龙病不同时期和不同品种的植物寄主样本中,14对引物表现出较强的特异性和稳定性。内参基因稳定性排名:ftsZ>gyrA>rpoB1>ftsA>secA>gap>zapE>gmk2>rpoD>secY>rpoO>ftsW>gmk1>recA,根据geNorm配对变异值Vn/n+1选择稳定性最好的ftsZ和gyrA作为内参基因作进一步评估。以ftsZ+gyrA以及16S rRNA基因分别作为内参基因检测柑橘黄龙病菌致病基因LasΔ5313的表达水平,所得的表达模式相同。【结论】柑橘黄龙病菌中涉及DNA复制和细胞分裂功能的管家基因表达较稳定,在CLas的基因表达研究中可选择ftsZ+gyrA的基因组合作为内参。本研究为后续利用实时荧光定量PCR分析CLas基因表达及研究CLas致病机理奠定基础。