亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的临床应用进展

输血安全面临免疫反应和感染风险两大管控点。保障血制品的安全是血液管理的核心,也是临床用血的基本要求。选择合适的病毒灭活技术是降低经血传播病毒风险的重要手段。理想的病毒灭活方法应能有效地杀灭和去除病原体,并最大限度地减少对血制品有效成分的损伤。亚甲蓝光化学法是一种采用光敏剂与光照相结合的技术,能灭活多种病毒,保障血浆制品的安全,具有广阔的应用前景。

利用动物模型评估亚甲蓝光化学法红细胞病毒灭活效果

目的 评估亚甲蓝光化学法 (MB P) (亚甲蓝浓度 5 μmol/L ,光照时间 1h ,光照强度 380 0 0lux)红细胞病毒灭活的安全性、有效性。方法 ①建立Beagle犬急性失血性贫血模型 ,观察经MB P处理的Beagle犬自体纠正贫血的效果、体内溶血情况及对肝肾功能的影响 ;②将含不同基因组拷贝数的鸭乙肝病毒 (DHBV)的人红细胞经静脉感染 1日龄雏鸭。采用同位素核酸杂交法检测鸭血清中DHBVDNA ,计算病毒灭活前后人红细胞中DHBV的半数致死量 (ID50 ) )。结果 ①经MB P处理的犬自体红细胞输入Beagle犬体内未发生溶血 ,输血前后谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、尿素、肌酐等与输血前比较无明显差异 ;②经MB P灭活处理后 ,含DHBV红细胞的ID50 由 1 0 3 .3 5变为 1 0 8.3 5拷贝。结论 红细胞MB P病毒灭活是安全有效的。

亚甲蓝光化学法对血浆凝血因子活性的影响研究

目的考察亚甲蓝光化学法中各种因素对血浆凝血活性和主要成分的影响。方法将血浆分为3组,每组10袋(200 m l/袋),加入亚甲蓝至终浓度为1μmol/L,分别采用照度为2 000 lux的红光(Ⅰ组)、10 000 lux的荧光(Ⅱ组)和30 000 lux的荧光(Ⅲ组)照射30 m in,然后采用3种不同灭菌方式(高压蒸汽、环氧乙烷和辐照灭菌)的滤器过滤去除血浆中的亚甲蓝。检测处理前后血浆的PT、APTT、FⅧ、纤维蛋白原等的变化情况。结果加入亚甲蓝前后,血浆的PT、APTT无明显差异,FⅧ∶C分别为(103.96±2.54)%vs(95.50±1.92)%。不同的光源光照后,3组血浆的PT在光照前后无明显差异。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组光照前后血浆的APTT分别为(34.93±1.26)svs(39.96±2.54)s,(35.87±1.83)svs(40.37±1.58)s,(35.73±1.92)svs(41.66±2.01)s。光照后3组血浆的FⅧ∶C的回收率分别为(89.05±1.36)%,(87.04±1.03)%,(84.62±0.51)%。采用不同灭菌方式的滤器过滤后,3组血浆的PT无明显差异。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆过滤前后的APTT分别为(39.96±2.54)svs(41.37±2.14)s,(40.37±1.58)svs(42.21±2.17)s,(41.66±2.01)svs(55.64±2.34)s。3组血浆经滤器过滤去除亚甲蓝后的FⅧ∶C的回收率分别为(93.75±1.23)%,(93.05±1.54)%,(58.61±1.17)%。亚甲蓝光化学法灭活病毒后滤除亚甲蓝的血浆的纤维蛋白原和总蛋白的回收率分别为(77.30±0.18)%和(97.57±1.78)%。结论亚甲蓝光化学法中亚甲蓝、光源、过滤对PT无明显影响,但APTT有所延长,且FⅧ和纤原都有不同程度的损失;高照度的荧光、辐照灭菌的滤器对APTT和FⅧ影响最大。

亚甲蓝光化学法灭活病毒的分子生物学机制

用模型病毒进行的基本反应机制研究表明,亚甲蓝(Methylene blue,MB)光化学法灭活病毒时形成的病毒RNA-蛋白交联是导致病毒灭活的主要损伤。此外,氧,特别是亚甲蓝被光激活后通过II型途径所产生的单线态氧,对亚甲蓝光化学法灭活病毒也起到重要作用。

亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活前后血浆成分的变化

目的探讨亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry,MB-P)病毒灭活前后血浆有效成分及残留白细胞含量的变化,为临床应用病毒灭活血浆进行治疗提供剂量使用依据。方法对152份全血分离制备的血浆进行MB-P病毒灭活,灭活前后留样,制成新鲜冰冻血浆后融化,测定纤维蛋白原、因子、总蛋白及残留白细胞的含量,同时计算有效成分回收率。结果经MB-P病毒灭活后新鲜冰冻血浆中因子和纤维蛋白原含量明显降低,差异有统计学意义;但总蛋白含量无明显变化,因子回收率达到80.8%,纤维蛋白原回收率为74.9%;残留白细胞计数由(3.0±2.1)×106/L下降到(7.4±1.4)×104/L(n=30),差异有统计学意义(P<0.05)。结论MB-P病毒灭活血浆可以提高血浆输注安全性。建议临床应用MB-P病毒灭活血浆应在原使用剂量基础上增加25%的用量,以保证临床治疗效果。

亚甲蓝光化学法降解丙型肝炎病毒核酸的研究

目的研究亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry,MB-P)降解病毒核酸的作用机制,为该方法在临床血液制品病毒灭活中的应用提供理论依据。方法以丙型肝炎病毒(HCV)为研究对象,选择HCV基因组中相对保守的5′-NCR为模板,应用荧光定量PCR技术观察不同处理时间HCV RNA降解情况。同时,对体外转录的同区段的HCV RNA在无蛋白成分的代血浆(羟乙基淀粉20-氯化钠注射液)及PBS缓冲液中的降解模式进行分析。结果MB-P处理条件下,HCV RNA含量呈对数形式下降,该方法对体外转录RNA的灭活效率低于对血浆中病毒颗粒的灭活效率。结论亚甲蓝能作用于病毒核酸,在光照条件下使RNA迅速降解,从而达到病毒灭活的效果。

光照度对亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的影响

目的在亚甲蓝(Methylene Blue,MB)光化学法灭活血浆病毒的过程中,采用不同光照度对血浆进行灭活,探讨血浆主要生化指标的变化情况,以找出对血浆影响最小的灭活光照度。方法将300袋机器单采血浆(200ml/袋),处理为含MB浓度为1μmol/L的MB血浆。分3组(100袋/组),分别置于3种不同光照度下处理35min(其它灭活条件相同),并检测血浆相关质控指标。结果在MB光化学法灭活血浆的过程中,不同光照度对血浆总蛋白浓度和凝血因子Ⅷ含量会造成不同影响,而对血浆其它主要成分和生化指标的影响不明显。结论初步证明,当可见光的光照度为30000—33000Lux时,MB光化学法灭活血浆的主要成分和生化指标变化最小,较适合于输注人体。

亚甲蓝光化学法灭活病毒的研究——抗坏血酸对血浆凝血因子的保护作用

目的 探讨抗坏血酸对亚甲蓝光化学法处理血浆时指示病毒灭活的效果 ,以及对部分凝血因子的保护作用。方法 采用CPE法评价病毒的灭活效果 ,用Clauss法测定纤维蛋白原的含量和一期法判定FⅧ :C的凝血活性。结果 在单采人血浆中加入 1μmol·L-1亚甲蓝和 2 4 0 μmol·L-1抗坏血酸 ,再给以 4 0 0 0 0lx荧光强度照射 6 0min ,VSV滴度下降 >8lgTCID50 ·ml-1,并且纤维蛋白原和FⅧ :C的回收率分别为 83.5 5 %和 81.6 7% ,比常规亚甲蓝 /荧光光化学法显著提高 (P <0 .0 1) ,而且凝血酶原时间延长值在正常允许值范围 ,活化部分凝血酶时间延长值也接近正常允许值范围。加入抗坏血酸和色氨酸可灭活病毒 ,而甘露醇不能。结论 在亚甲蓝光化学法中 ,抗坏血酸不影响病毒的灭活 ,而且对部分凝血因子有保护作用。因此 ,抗坏血酸可以有效提高单份冷冻新鲜人血浆的质量。

亚甲蓝光化学法对红细胞膜的损伤

目的 为进一步完善和发展亚甲蓝光化学法 ( MB-P)在红细胞制品病毒灭活中的应用提供理论依据。方法 应用 MB-P法 (光照时间 60 min,MB浓度 5μmol/L,光强度 3 .8× 1 0 4 lx)处理人红细胞悬液后 ,用不同方法测定红细胞溶血度、膜脆性、膜乙酰胆碱酯酶 ( Ach E)活性、膜蛋白浓度、膜脂质流动性、膜脂质过氧化产物含量 ( MDA)、2 ,3 -DPG和 ATP含量。结果 MB-P法对人红细胞有一定的损伤 ,损伤效应与 MB的浓度和光照时间有关。结论 MB-P引起红细胞膜氧化损伤的分子机制主要是 1 O2

丙型肝炎病毒样颗粒作为亚甲蓝光化学法灭活HCV效果评价物的可行性研究

目的探讨丙型肝炎病毒样颗粒(HCVLPs)在亚甲蓝光化学灭活处理过程中的变化趋势及其作为亚甲蓝光化学法灭活HCV效果评价物的可行性。方法以HCV阳性血浆作为平行对照组(HCV RNA载量约6.53 logcopies/m L)(n=6),将HCVLPs用代血浆调整成合适浓度(HCV RNA定量约为6.74 logcopies/m L)的悬液作为实验组(n=5),将2组分装至PVC血袋中,MB+L 1μmol/L进行病毒灭活处理,分别于光照处理0、5、10、20、30 min时取样,用荧光定量PCR技术检测病毒核酸载量;同时以细胞病变法测定HCV模型病毒sindbis病毒的残余滴度,验证MB+L灭活HCV的效果。结果模型病毒sindbis的病毒滴度降至检测限以下(log TCID50/m L≤0.5);MB+L处理过程中,随着光照处理时间的增加,HCV及HCVLPs的核酸载量明显下降,分别从6.53与6.74下降至4.51和2.89log copies/m L(P<0.05),且2组在不同取样点的HCV RNA载量之间具有相关性(R2>0.98,Significance F<0.01)。结论 HCVLPs能够反映MB+L灭活处理中HCV RNA动态变化,或有望成为安全而有效的HCV灭活评价物来监控HCV灭活效果。

运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆丙型肝炎病毒的灭活效果

目的:通过荧光定量PCR（FQ-PCR）技术对血浆病毒灭活前后丙型肝炎病毒RNA（HCV-RNA）浓度的测定,判断亚甲蓝（MB）光化学法灭活血浆丙型肝炎病毒的效果,为临床判别病毒灭活效果提供直接和客观依据。方法:4份经证实为HCV-RNA阳性的血浆分别加入MB,终浓度为1μmol/L,经可见光（大于30000Lux）照射不同时间（0、5、10、15和30min）后,分别用FQ-PCR测定这些血浆的HCV-RNA浓度,并与未用MB处理的血浆作比较,判断随照射时间不同,HCV被灭活的效果。结果:4份HCV-RNA阳性病人的血浆未经处理时其病毒核酸浓度分别为8.0X105拷贝/ml、1.7X106拷贝/ml、1.6X106拷贝/ml和 3.1X105拷贝/ml,加入MB未经照射时HCV-RNA浓度即明显下降,可见光照射5 min后HCV-RNA浓度分别下降为未经任何处理时浓度的18.75％、23.36％、4.66％和1.27％,随照射时间延长,病毒核酸浓度逐渐下降,照射30min后,HCV-RNA浓度均下降为零。结论:用MB加光照30min处理,可达到将血浆丙肝病毒灭活的效果;FQ-PCR可定量检测MB光化学法灭活丙肝病毒的过程。

药物对亚甲蓝光化学法损伤红细胞的保护

目的 探讨择定条件下亚甲蓝光化学法 (methylenebluephotochemical,MB P)对红细胞质量指标的影响 ,最大限度地保护红细胞。方法 采用MB P法 (光照时间 6 0min ,MB浓度 5 μmol/L ,光强度 3 8× 10 4lx)处理人红细胞悬液后 ,测定甘露醇、L 组氨酸、SOD对膜脂质过氧化的抑制率。结果 L 组氨酸的抑制作用最强。结论 经L 组氨酸保护后 。

乳糜血对亚甲蓝光化学法制备病毒灭活血浆的影响

目的探讨乳糜血浆经亚甲蓝光化学法病毒灭活后，产品外观、血浆蛋白含量及亚甲蓝残留量是否符合GB18469《全血及成分血质量要求》，为临床合理使用血浆提供参考。方法血站采集后保存48h内的无偿献血者血液，离心分离出血浆，用作者自制比浊图片卡按乳糜血指数≤2，3～5，〉5标准选出轻、中、重度三组乳糜血浆（100ml／袋）各20袋作为研究对象，同时在光照度35000lUX、温度4℃作用30min，进行亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后按标准操作规程检测各袋病毒灭活血浆外观、血浆蛋白含量、亚甲蓝残留量。结果轻度乳糜血病毒灭活产品外观呈淡黄色澄清液体、血浆蛋白含量〉50g／L、亚甲蓝残留量（0．210±0．024）μmol／L；中度乳糜血病毒灭活产品外观呈淡黄色或淡绿色澄清液体、血浆蛋白含量〉50g／L、亚甲蓝残留量（0．261±0．031）μmol／L；重度乳糜血病毒灭活产品外观呈淡绿色浑浊不透明液体、血浆蛋白含量〉50g／L亚甲蓝残留量（0．3424-0．029）μmol／L；且亚甲蓝残留量与乳糜血程度呈正相关，轻、中度组比较t=5．67，P〈0．01，中、重度组比较t=8．32，P〈0．01，轻、重度组比较t=15．3，P〈0．01。结论轻、中度乳糜血经亚甲蓝光化学法制备病毒灭活血浆符合GB18469，可供临床使用；重度乳糜血制备病毒灭活血浆除血浆蛋白符合标准外，血浆外观、亚甲蓝残留量均不符合GB18469，不适合供给临床。

亚甲蓝光化学法病毒灭活对血浆质量的影响分析

目的探讨亚甲蓝光化学法灭活对于血浆质量的影响。方法于2011年3月至2012年3月随机抽取新鲜血浆,进行亚甲蓝光化学法病毒灭活,并检测其在灭活前后质量的变化,包括凝血因子活性及蛋白质含量。结果在进行亚甲蓝光化学法血浆灭活后,将其各项质量指标的数据与灭活之前相比较,并使用统计学处理,P>0.05,实施两组数据没有显著差异。结论亚甲蓝光化学法病毒灭活对血浆质量几乎没有影响,与新鲜血浆的临床效果无异,该灭活方法值得推广。

亚甲蓝光化学法灭活血液中HBV的初步探讨

目的:研究亚甲蓝光化学法对HBV的灭活效果。方法:选择慢性乙型病毒性肝炎患者30例,抽取其静脉血并使用亚甲蓝光化学法灭活HBV,以500μmol/L亚甲蓝灭活病毒1.5h后评价灭活效果,并检测灭活前后红细胞功能。结果:患者血液中HBV DNA拷贝数由灭活前的(1.19×107±1.23×106)copies/ml减少至灭活后的(3.46×105±5.01×104)copies/ml(P<0.05);红细胞丙二醛由灭活前的(2.5±0.2)mmol/L增加至灭活后的(9.1±1.7)mmol/L(P<0.05),而2,3-二磷酸甘油酸、Na+K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、血浆游离血红蛋白等无明显变化。结论:亚甲蓝光化学法能降低血液中HBV载量,对红细胞功能无明显影响。

亚甲蓝光化学法对血浆中水疱口膜炎病毒灭活效果的研究

目的评价亚甲蓝光化学法(MBP)对血浆中水疱口膜炎病毒(VSV)的灭活效果。方法将7.12 logTCID50.mL-1VSV加入血浆中,采用不同的参数组合[亚甲蓝(MB)浓度(0.8、1.3μmol.L-1)、光照强度(20 000、50 000 LUX)、光照时间(10、20、30 min)]灭活处理后,分别将样品加入非洲绿猴肾细胞(Vero)单层细胞中培养,观察细胞病变(CPE)状况,评价病毒灭活的效果。结果经过30 min灭活处理,可将病毒彻底灭活,病毒滴度下降6 log值以上。实验设置的MB浓度和光照强度对血浆病毒灭活的影响不明显。结论在MB浓度为0.8μmol.L-1和光照强度20 000 LUX的条件下,处理血浆30 min以上就能有效灭活血浆中的VSV病毒。

亚甲蓝光化学法病毒灭活前后血浆凝血因子等的质量分析

目的探讨亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry,MB-P)病毒灭活前后血浆成分的活性与含量,为国家制定病毒灭活血浆的质量标准提供参考依据。方法随机抽取40人份全血按照标准操作规程制备新鲜血浆和病毒灭活新鲜血浆,同1人份制备的新鲜血浆分2组留样,1组为不灭活的新鲜血浆(记为灭活前组),另1组为病毒灭活后新鲜血浆(记为灭活后组),检测灭活前后样本的FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、Fg和总蛋白含量的变化。结果病毒灭活前后FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、Fg的含量比较:t值分别为7.335 2、6.169 3、6.091 3、6.808 1、10.397 2、7.448 3、13.806 1,均为P<0.05;总蛋白含量:灭活前61.5±6.98、灭活后62.00±5.93,t为0.422 9,P>0.05。结论血浆经亚甲蓝灭活处理后6种凝血因子活性及纤维蛋白原含量均降低,总蛋白含量无明显差异,说明病毒灭活对血浆成分的活性损伤是存在的,但在可接受的范围内。

亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的临床应用

随着人类医学的不断发展和进步,输注血浆已-成为临床上治疗多种疾病的重要治疗手段,因此血浆的安全性受到广泛关注。如我国上海。每年有15~20万人次接受输血治疗,其中约有40%输注血浆。输注血浆能治疗疾病。但血浆中可能携带的一些病毒,如人类免疫陷缺病毒(HIV)、人类T细胞白血病病毒(HTLV)、肝炎病毒(HBV、HCV、HDV、HEV、HAV、HGV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、小病毒B19、新克雅氏病毒、SARS冠状病毒和West Nile病毒等,也可能引起输血相关的病毒性传染病。目前,有3道安全防线用于控制经输血传播病毒性传染病的发生率。除谨慎地筛选无偿献血者(第一道)和严格地进行病毒筛查检测(第二道)外。

亚甲蓝光化学法病毒灭活对新鲜冰冻血浆有效成分的影响

目的了解亚甲蓝光化学法病毒灭活对新鲜冰冻血浆有效成分的影响,为临床治疗提供依据。方法取50袋(400 ml/袋)新鲜无偿献血者血液,在6 h内完成血浆分离,并立即行亚甲蓝光化学法病毒灭活(灭活条件为光照度35 000 LUX、温度4℃、作用时间30 min),灭活前后留取小辫,贴好标签后立即置速冻冰箱冻存;冻存1周后37℃依次解冻,采用凝固法检测Ⅷ因子含量、双缩脲法检测总蛋白含量,以灭活后含量/灭活前含量计算有效成分保有率。结果亚甲蓝光化学法病毒灭活前后血浆Ⅷ因子及总蛋白含量均较灭活前显著降低(P均<0.05),其保有率分别为80.88%、95.69%。结论对血浆进行亚甲蓝光化学法病毒灭活可导致Ⅷ因子含量减低;由新鲜冰冻血浆和普通冰冻血浆制备的病毒灭活血浆需考虑用于不同患者。

亚甲蓝光化学法灭活对血浆HBV前S2基因降解的研究

目的探讨亚甲蓝处理HBV血浆前S 2抗原(HBV Pre S2-Ag)与其DNA降解的关系。方法将乙肝表面抗原和前S2抗原均阳性的血浆,分为未处理组,亚甲蓝处理0、5、10、20、35 min,共6组,每组20 m L。ELISA检测处理前后pres2蛋白变化;设计多对引物,含重叠区,检测pres2基因DNA完整性。结果亚甲蓝能降解DNA序列,并且呈现区域特异性。结论亚甲蓝在基因水平灭活病毒,并且呈现核酸序列特异性,对pres2蛋白含量没有影响。运用核酸检测技术,对评价血浆HBVpres2基因病毒灭活效果的有一定的意义。