亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究

【目的】研究亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WU14亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Nir S)的作用机制,为发酵食品中应用乳酸菌纯种培养技术降解亚硝酸盐奠定基础。【方法】在37℃培养条件下,测定含0.02%—0.16%Na NO2的MRS培养液中L.plantarum WU14 24 h的生长密度、p H及Na NO2降解量。通过PCR扩增和TA克隆得到Nir S,并克隆到乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体p RNA48中,获得重组菌L.lactis NZ9000/p RNA48-Nir S。重组菌经30 ng·m L-1 nisin诱导后,经SDS-PAGE和盐酸萘乙二胺法分析目的蛋白的表达情况及Nir S酶活。通过生物信息学软件预测分析Nir S编码的蛋白质二三级结构、跨膜结构及疏水性。【结果】L.plantarum WU14能够在Na NO2浓度小于0.12%的MRS培养基中生长并降解一部分Na NO2,在0.10%Na NO2培养液中发酵24 h后降解量达到最大,为56.34μg·m L-1,Nir S酶活达2 347.5 U·m L-1。Nir S编码的蛋白质是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。Nir S可在L.lactis NZ9000中高效表达,该重组菌能够在Na NO2浓度低于0.10%的GM17培养基中生长并降解一部分Na NO2,在含0.04%Na NO2的培养液中亚硝酸盐降解量达到最大,为22.21 mg·m L-1,Nir S酶活为925.41 U·m L-1。【结论】L.plantarum WU14的Nir S能够降解高浓度的亚硝酸盐,并且经食品级异源表达的Nir S具有较高的酶活力。本研究为探索研究亚硝酸盐降解的机理,建立发酵食品中亚硝酸盐降解的可控发酵体系提供了参考。

急性亚硝酸盐胁迫对红耳龟和中华条颈龟幼体抗氧化能力的比较研究

为了比较红耳龟(Trachemys scripta elegans)与本地龟抗氧化损伤的能力,选取体重为5?1 g的红耳龟(n=18)和中华条颈龟(Mauremys sinensis)(n=18)幼体暴露于3个亚硝酸盐浓度组(0、50、500 mg?L–1),进行24 h急性胁迫实验。结果表明:(1)随着亚硝酸盐浓度的升高,红耳龟肝组织中积累的亚硝酸盐量显著低于中华条颈龟(p<0.05),肠组织中的积累量则相反,这说明红耳龟对亚硝酸盐的代谢及解毒能力要强于中华条颈龟;(2)两种龟肝组织和肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力显著低于对照组(p<0.05),且同一浓度组内红耳龟SOD活力略高于中华条颈龟,但差异不显著;两种龟肝组织和肠组织中丙二醛(MDA)含量随亚硝酸盐浓度的升高而显著升高,相比于红耳龟而言,中华条颈龟的上升趋势更加显著,说明亚硝酸盐浓度的升高对龟体产生了氧化性损伤且中华条颈龟的损伤程度要高于红耳龟;(3)两种龟红细胞微核率随亚硝酸盐浓度升高而升高,且高浓度组中中华条颈龟略高于红耳龟。综上所述,红耳龟幼体在亚硝酸盐胁迫下,其机体的氧化损伤程度要弱于中华条颈龟。

高亚硝酸盐胁迫下日本囊对虾肝胰腺的转录组分析

为研究日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)耐高亚硝酸盐的分子调控机制,利用新一代高通量Illumina测序技术,对日本囊对虾在高亚硝酸盐胁迫下的肝胰腺进行转录组测序,通过对高质量序列的拼接组装以及功能基因的注释和分类,发掘与耐高亚硝酸盐相关性状的候选基因。实验结果表明:①10个文库共获得920785608个净读本,数据量为6.48G~7.34G。②Q30>93.07%。利用Trinity软件组装后获得46308条单基因簇,N50为1833 bp。③与对照组相比,高亚硝酸盐组分别识别出593、606、1089、497和988个差异表达基因。④对DEGs进行功能注释,得到与免疫和代谢相关的通路和基因。⑤采用qPCR对随机选择的9个差异基因(DPD、ABCH、ProPOb、ACADL、CYP2J、PAT4、BHMT、CLEC和PEPCK)在高亚硝酸盐胁迫下的表达情况进行检测,其表达量与转录组测序技术(RNA Sequencing,RNA-seq)趋势一致。本研究结果丰富了对虾cDNA数据库的信息,为日本囊对虾在高亚硝酸盐胁迫下的分子机制研究奠定了基础。

波纹龙虾对亚硝酸盐胁迫响应的转录组学分析

为了探究波纹龙虾Panulirus homarus对亚硝酸盐的胁迫响应机理,采用转录组学测序分析方法,进行了正常养殖条件下波纹龙虾(体质量为39.00 g±5.31 g)肝胰腺和质量浓度为80 mg/L亚硝酸盐胁迫7 d的肝胰腺转录组比较研究。结果表明:转录组共筛选得到264个差异表达基因,其中,86个基因上调表达,178个基因下调表达;GO功能注释显示,被注释的差异表达基因主要与结合、催化和代谢等功能有关;KEGG通路富集分析显示,差异表达基因在黏着斑、白细胞跨内皮层迁移、胰岛素抵抗、紧密连接、淀粉与蔗糖代谢等通路中显著富集;随机挑选9个差异表达基因进行qRT-PCR验证,发现荧光定量结果与测序结果基本一致。研究表明,在亚硝酸盐胁迫下,通过GO和KEGG分析发现差异表达基因主要富集在能量代谢、生长和免疫等通路中,挖掘出的数据可为后续研究提供科学参考。

慢性亚硝酸盐胁迫对子二代中华鲟生长、抗氧化及免疫指标的影响

以子二代中华鲟(Acipenser sinensis)为实验对象,研究不同亚硝酸盐浓度(0.01、0.20、0.40、0.80、1.60 mg·L-1)慢性胁迫(60 d)对鱼体生长、抗氧化及免疫指标的影响。结果显示,高浓度组子二代中华鲟发生死亡现象,死亡率为33.33%,其他各组存活率均为100%;试验鱼的增重率和特定生长率随亚硝酸盐浓度的增加而逐渐降低(P<0.05),而脏体比、肝体比和肥满度无显著变化(P>0.05)。在抗氧化指标中,血清和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)活性及谷胱甘肽(GSH)含量随亚硝酸盐浓度的升高而下降,而丙二醛(MDA)含量随亚硝酸盐浓度的升高而上升。免疫指标中,随着亚硝酸盐浓度的升高,血清、肝脏溶菌酶(LZM)活性和免疫球蛋白M(IgM)含量均显著下降(P<0.05)。结果表明,慢性亚硝酸盐胁迫显著抑制了子二代中华鲟的生长,降低了鱼体的抗氧化能力和免疫能力,这对了解中华鲟亚硝酸盐胁迫反应以及其健康养殖具有重要的借鉴意义。

亚硝酸盐胁迫下发酵甘草对斜带石斑鱼血液指标与抗氧化能力的影响

试验旨在探究在饲料中添加发酵甘草对亚硝酸盐胁迫下斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)成活率、血液指标与抗氧化能力的影响。分别添加0.25%、0.50%发酵甘草的饲料投喂斜带石斑鱼幼鱼,经过8周的养殖试验后进行亚硝酸盐胁迫试验。结果表明,亚硝酸盐胁迫后,添加0.25%发酵甘草组的存活率显著高于对照组(P<0.05)。添加0.25%、0.50%发酵甘草的血浆中的ALT活性均显著降低(P<0.05),血液皮质醇水平与对照组没有显著差异(P>0.05),添加0.50%的发酵甘草能够显著降低血浆中的HSP70含量(P<0.05);饲料中添加发酵甘草能够提高肝脏的SOD与GSH-Px的活性;添加0.25%、0.50%发酵甘草组的GSH-Px、T-AOC活性显著高于对照组(P<0.05),各添加组肝脏的MDA含量均显著降低(P<0.05)。

亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹相关免疫指标的影响

【目的】探讨亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)机体免疫力的影响,为拟穴青蟹养殖模式调整与产业化升级提供基础资料。【方法】测定拟穴青蟹在不同浓度亚硝酸盐(0 mg/L、20 mg/L、60 mg/L、100mg/L、140mg/L)胁迫下其组织中碱性磷酸酶(AKP)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量在受胁迫48h内的动态变化。【结果】亚硝酸盐胁迫浓度达60mg/L以上时,青蟹肝胰腺及肌肉中AKP活力变化显著,肌肉中AKP活力随时间增加呈先升高后降低趋势,各组织中CAT活力变化也呈先升高后降低趋势,表现出一定的"毒兴奋效应",肝胰腺及鳃中MDA含量则随胁迫时间与胁迫浓度变化呈递增趋势。【结论】亚硝酸盐胁迫可通过破坏组织中非特异性免疫酶类体系运转,加剧组织中脂质过氧化方式导致机体免疫力下降。在拟穴青蟹人工养殖中,将亚硝酸盐浓度控制在20mg/L以下,有助于青蟹养殖模式调整与产业化升级。

亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹幼体相关免疫指标和应激蛋白(HSP70)表达的影响

为探讨亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹机体免疫力的影响,以及机体在胁迫过程中的应对策略,分别测定了幼蟹(平均体重3.25 g)在10、20、30、40 mg L-1亚硝酸盐暴露组和对照组中血细胞总数(Total hemocyte counts,THC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(Malodiadehyde,MDA)含量以及热休克蛋白70(Heatstress protein 70,HSP70)表达量在受胁迫2 d内的动态变化.结果表明:1)低浓度亚硝酸盐(10 mg L-1)胁迫组THC在胁迫3 h时显著高于对照组,肝胰腺中SOD活性在胁迫3 h和6 h时亦显著提高,表现出一定的"毒物兴奋效应".2)但随着暴露时间的延长和亚硝酸盐浓度的升高,幼蟹THC减少,肝胰腺SOD活性下降,而MDA含量升高.3)对照组中有少量的HSP70表达.幼蟹经10、20 mg L-1亚硝酸盐处理后,鳃组织中HSP70表达量在胁迫6 h后达到最大,而经30、40 mg L-1亚硝酸盐处理后,HSP70表达量在胁迫3 h后达到最大.各浓度组所诱导的HSP70最大表达量与水中亚硝酸盐的浓度呈正相关.以上结果说明亚硝酸盐胁迫可通过加剧组织中脂质过氧化的方式导致机体免疫力下降,肝胰腺中MDA的含量变化可作为亚硝酸盐胁迫的有效评价指标之一,而HSP70表达量的变化可作为早期预警指标应用于亚硝酸盐胁迫评价中.

饲料中牛磺酸含量对淡水养殖凡纳滨对虾生长、体组成、消化酶活性及抗胁迫能力的影响

为探究饲料中牛磺酸含量对淡水养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、消化酶活性及抗胁迫能力的影响,在10%鱼粉的基础上设计牛磺酸添加量分别为0(A组)、0.15%(B组)、0.30%(C组)、0.45%(D组)和0.60%(E组)的等氮等能饲料(A、B、C、D和E饲料中实测牛磺酸含量依次为1.42、3.07、4.37、5.79和7.48 mg/g饲料),分别投喂初始体质量(0.160±0.002)g的幼虾56 d。养殖实验结束后,测定对虾的生长性能、肌肉常规组成、肝胰腺消化酶活性。而后分别取各组对虾进行亚硝酸盐急性胁迫实验和耐低溶解氧胁迫实验。结果表明:饲料中牛磺酸含量对凡纳滨对虾的生长性能无显著影响(P>0.05)。随饲料牛磺酸含量的增加,对虾肌肉总脂肪含量逐渐升高,D组和E组显著高于其他各组(P<0.05);肌肉水分含量逐渐下降,A、B和C组显著高于D和E组(P<0.05);肌肉粗蛋白质及灰分含量各组之间无显著差异(P>0.05)。肝胰腺中蛋白酶及脂肪酶活性随饲料中牛磺酸含量的升高而升高,D和E组显著高于其他各组(P<0.05)。在水体亚硝酸盐含量为8.5~9.0 mg/L条件下,D组在胁迫48、72和84 h后的累计死亡率低于其他各组。在低氧胁迫下,C组的致死溶氧低于其他各组。表明在淡水养殖条件下,低鱼粉饲料(鱼粉含量10%)中添加0.30%~0.45%的牛磺酸(实测含量4.37~5.79 mg/g饲料)在维持良好生长性能的同时可改善凡纳滨对虾的抗亚硝酸盐和耐低溶解氧胁迫的能力。