Bacillus subtilis 168中亚硝酸盐还原酶基因的敲除及表型鉴定

该研究首先通过同源重组方式将Bacillus subtilis 168菌株nir基因位点置换为两端具有同向排列的loxP序列选择性标记基因,再运用Cre重组酶将两个loxP间的全部序列切除,成功敲除了Bacillus subtilis 168菌株亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的3个亚基基因nasB、nasD和nasE。其中,敲除nasD基因的B.subtilis 168菌株在不同生长时期均未分解培养基中亚硝酸盐,表明该nasD基因缺陷型菌株NiR活性已被完全消除,不再具备降解亚硝酸盐的能力。

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a(+)中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL(DE3)中,表达产物有酶活。

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。

木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达

目的:对木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因(nir)进行克隆并表达,并测定酶的活力,探讨亚硝酸盐还原酶(NiR)对亚硝酸盐的降解特性。方法:提取木糖氧化产碱菌DNA,根据GenBank公布的nir基因序列设计引物,利用PCR技术扩增nir基因,克隆至表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-nir,通过双酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白。将细胞发酵液超声破碎,提取粗酶,测定酶活力。结果:经PCR扩增及测序鉴定得到长度为1 083bp的目的片段;经终浓度0.6mmol.L-1IPTG、30℃诱导表达5h,获得相对分子质量为37 000的重组蛋白;在pH6.5、反应温度35℃时,测得酶活力为51.74U.mL-1。结论:成功克隆nir基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,且表达产物有酶活。

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

利用克隆表达技术,对一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01的亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Ni R)基因进行克隆、原核表达,利用Ni柱亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析对表达的重组NiR进行纯化,分析重组酶的性质。研究结果显示,该NiR含有一个1 623 bp的开放阅读框,编码540 个氨基酸序列,重组NiR的分子质量约为67 ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0 mg/kg和184.5 mg/kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。

Cd1-型亚硝酸盐还原酶脱氮工程菌的构建与表达

目的用基因工程技术将铜绿假单胞菌PAO1中nirS基因定向克隆至表达载体pQE-30上，使nirS基因得到高效表达。方法根据GenBank公布的nirS碱基序列和表达载体pQE-30的多克隆位点设计引物，以铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA为模板，应用PCR技术扩增目的片段nirS；之后经过BamH I和HindⅢ双酶切，定向克隆到pQE-30上，化学转化DH5α，构建含有重组质粒的转化子pQE30-nirS-DH5α；经酶切和测序鉴定，扩增产物的碱基序列与GenBank公布的序列完全吻合，再将重组质粒pQE30-nirS转化表达菌株SG13009构建脱氮基因工程菌pQE30-nirS-SG-13009（PNS）。最后用SDS-PAGE（IPTG浓度：0．05mmol／L；诱导温度：25℃；诱导时间：2～3h）和His-tag in-gel Stain鉴定cd1-型亚硝酸盐还原酶的分子量与特异性。结果构建了高效表达cd1-型亚硝酸盐还原酶的脱氮基因工程菌PNS。结论Cd1-型亚硝酸盐还原酶能够在脱氮基因工程菌PNS中得到正确和高效的表达。

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于p ET-32a(+)-nirBL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B. cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。

植物乳杆菌DMDL 9010降解亚硝酸盐特性及其相关基因挖掘

笔者前期对植物乳杆菌DMDL 9010(Lactiplantibacillus plantarum DMDL 9010,LP9010)已进行全基因组测序,其NCBI登录号为CP063986-CP063988。该文通过研究LP9010在不同培养条件和培养基成分下的理化指标变化,结合全基因组序列初步分析LP9010降解亚硝酸盐的特性。结果表明,LP9010具有高效降解亚硝酸盐的能力,其亚硝酸盐降解率随着pH的降低而升高;温度为37℃有利于LP9010降解亚硝酸盐;LP9010在营养充分的条件下降解亚硝酸盐的效果最佳,且氧环境和生长因子对其无显著影响(p>0.05)。相应地,在LP9010全基因组中发现了酸耐受(nhaC、gadA、argG和glnR)、冷热耐受(cfa、cspA、hrcA、htpX、cplC、clpE、clpP、clpX和clpL)、氧耐受(catB、trxB、trxA、gor、msrC、msrA和msrB)以及糖转运(pstI、Crr、NagE、ScrA、MtlA、ManX、ManY、ManZ、GatA、GatB、GatC、FruA和FruB)相关的基因,尤其是发现了亚硝酸盐还原酶基因(lmrB和pgl)。总之,LP9010具有高效降解亚硝酸盐的能力和降解亚硝酸盐相关的基因。此结果为植物乳杆菌降解亚硝酸盐的机理提供了新的思路。

nirS基因重组工程菌降解亚硝酸盐的初步研究

通过基因工程手段增加厌氧氨氧化菌亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,nirS）的表达量,运用质粒载体p GEM-T克隆nirS基因。琼脂糖凝胶电泳检测显示,nirS基因重组工程菌在440 bp处有明显的目的条带;nirS基因重组工程菌扩大培养7-8 h后即达到生长曲线稳定期,引入外加氮源后,菌体生长情况更优。通过不同菌液投加量以及处理不同初始浓度的亚硝酸钠溶液,检测nirS基因重组工程菌的性能。结果表明,当nirS基因重组工程菌投加30 m L（细菌数为2.3×10^7个/m L）,亚硝酸盐初始质量浓度为40 mg/L时,亚硝酸盐去除率达到90%以上。nirS基因重组工程菌可适用于亚硝酸盐废水的处理。

产亚硝酸还原酶基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的培养基优化

从豆瓣酱中筛选的一株能高效降解亚硝酸盐的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01,将其nir基因克隆至相应的表达载体上,构建了重组菌pET-28a(+)-nir-BL21。为提高基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的产亚硝酸盐还原酶(NiR)水平,对重组菌pET-28a(+)-nir-BL21的培养基组成通过单因素实验、Plackett-Burman和Box-Behnken试验优化。结果表明,获得最佳培养基为:以液体LB培养基为基础培养基,再添加葡萄糖3.72 g·L^-1、甘油2.63 g·L^-1和细菌学蛋白胨8.70 g·L^-1,活菌数预测值为3.14×10^8 CFU·mL^-1,通过验证得3.02×10^8 CFU·mL^-1,与预测值接近。本实验构建的高产亚硝酸盐还原酶的菌株,将为日后降解食品中的亚硝酸盐进行工业化应用提供理论基础。

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。

沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris2-8的亚硝酸盐还原酶基因克隆和序列分析

沼泽红假单胞菌2-8具有亚硝酸盐还原能力,根据不同类型亚硝酸盐还原酶保守序列设计引物,通过PCR扩增的方法对2-8菌株的亚硝酸盐还原酶类型进行鉴定,发现该菌株的亚硝酸盐还原酶为Cu型亚硝酸盐还原酶。从2-8菌株基因组中克隆出编码该Cu型亚硝酸盐还原酶的基因(nirK),该基因由1 154个碱基对组成,在GenBank数据库的登录号为GU332847,与沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris TIE和CGA009的nirK序列相似性为90%。互联网数据库及生物信息学分析工具分析显示,该基因编码的由370个氨基酸残基组成的蛋白是铜型亚硝酸盐还原酶,属于一型多铜氧化酶,pI 6.2,是一种稳定蛋白,定位于膜外或周质;由α螺旋、延伸带、随机卷曲和模糊状态组成;有4个2Fe-2S氧化还原蛋白型铁硫结合结构域和一个4Fe-4S氧化还原蛋白型铁硫结合结构域。经Northern杂交分析显示nirK基因在沼泽红假单胞菌2-8中以单拷贝的形式存在并表达。

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究

植物乳杆菌具有降解亚硝酸盐的能力。根据已知四种类型亚硝酸盐还原酶蛋白序列的保守序列,利用互联网相关蛋白分析软件及生物信息学工具,查找到植物乳杆菌基因组上的亚硝酸盐还原酶疑似基因8个,克隆出全部基因序列,分别构建表达载体p ET-32a(+)-Ni Rs。将构建的质粒转入BL21(DE3)表达菌的感受态细胞中进行诱导表达,表达的目的蛋白,经亚硝酸盐还原酶总活性测定试剂盒检测,结果显示,其中HP蛋白具有显著还原亚硝酸盐的能力。

两类产NO的亚硝酸盐还原酶的分布,结构与序列比较及宏基因组分析

【目的】为了体现亚硝酸盐还原酶在环境中氮生物循环的重要性,研究了它们的分布情况。【方法】利用现有亚硝酸盐还原酶序列在已经测序的基因组数据库中进行查找,研究该酶的分布情况,通过多序列比对比较了它们的序列相似性,通过构建系统发育树比较其进化关系,并利用宏基因组学的方法研究了它们在海洋宏基因组中的分布。【结果】分析结果显示,两类亚硝酸盐还原酶在已测序的细菌和古生菌基因组中分别有397和812个,分别占总量的8%和15.7%,几乎所有的古生菌都含有Ⅱ类酶;它们自身的序列相似性很高,在Ⅰ类酶和Ⅱ类酶中底物结合位点以及Ⅱ类酶的铜离子结合位点保守性都很高,显示该酶序列保守性与其环境功能相适应的特点;进化分析显示它们可能具有共同的进化来源;在海洋宏基因组中,平均每100000读数中分别有6个Ⅰ类和35个Ⅱ类,且2类酶都在热带南太平洋区域有最大分布。【结论】NIR在氮的生物循环及环境修复中可能起到重要作用。

氨氮降解菌Paraburkholderia fungorum Gan-35的基因组分析

为揭示赣南稀土矿山废弃地氨氮降解菌Gan-35的遗传背景,采用Illumina测序技术和生物信息学方法对Gan-35的基因组进行分析。获得了Gan-35的基因组草图序列。序列组装后得到49个scaffold,包含两条质粒序列,基因组大小为8.35 Mbp,GC含量为62.0%。Gan-35含有7519个基因,这些基因在GO注释中主要富集于“binding”“catalytic”等。KEGG注释显示,“ABC transporters”富集的基因最多。在Gan-35基因组中预测出457条串联重复序列、8个rRNA基因和54个tRNA基因,包括与硒代半胱氨酸对应的tRNA基因。Gan-35与Paraburkholderia fungorum BAA-463具有良好的基因组共线性关系。Gan-35基因组与其他基因组比较,有少量COG分类富集的基因数目出现显著差异。基于分析结果,将Gan-35的物种名称重新确定为Paraburkholderia fungorum Gan-35。从Gan-35基因组中鉴定出反硝化脱氮途径的硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因,并进行了验证。此外,还鉴定出氨同化作用的关键酶基因,但未找到硝化途径的主要酶基因。对Gan-35基因组的全面分析有助于后续深入研究氨氮降解机制和解决水产养殖中的氨氮污染问题。

棉花红腐病菌氮代谢途径相关酶的基因位点测定

通过对菌株同类型的nit突变体互补测定方法,对棉花红腐病菌(串珠镰孢霉)氮代谢途径相关因子的基因位点进行研究。根据对单孢菌株SC50的42个含钼协同因子缺陷型突变体(nitB)的互补测定,鉴定出至少有7个基因位点控制含钼协同因子;对硝酸盐还原酶缺陷型突变体(ni tA)间以及亚硝酸盐还原酶缺陷型突变体(nitC)间互补测定的结果表明,这两种酶均由多个基因位点控制,并有其它基因参与互作。

脱氮基因工程菌PNS在污水处理中的初步研究

目的探讨脱氮基因工程菌PNS在污水处理应用中的一系列参数。方法利用基因工程技术,将nirS基因定向克隆至高效表达载体pQE30上,构建重组基因工程菌pQE30-nirS-SG13009(PNS);然后用SDS-PAGE对PNS的最佳诱导浓度和最适诱导时间进行分析;最后将厌氧诱导和20℃诱导的PNS进行破碎、离心后分离沉淀液和上清液,再用SDS-PAGE分析其在厌氧环境和20℃的低温环境中表达形式。结果IPTG最佳诱导浓度为0.05mmol/L,最适诱导时间为2h;在厌氧和20℃环境中,PNS都能够表达可溶性cd1-亚硝酸盐还原酶。结论脱氮基因工程菌PNS在污水处理环境中能够表达具有生物学活性的cd1-亚硝酸盐还原酶。

养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征

利用间歇曝气选择性富集并对所获菌株的好氧反硝化活性进行检测。筛选到一株亚硝酸盐去除活性较高的好氧反硝化细菌。在溶解氧（D0）为3.80-5．21mg／L的培养条件下。该菌株10h内将亚硝态氮由26．18mg／L降至0；在盐度为0—25之间20h内均可达到同样的去除效果。通过形态学特征、生理生化反应及部分长度16SrDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定，初步判定它为嗜麦芽寡养单胞菌Stertotrophomonas maltophilia。亚硝酸盐还原酶基因分析结果表明。该菌株只含亚硝酸盐还原酶nitS基因，其序列与Alcaligenes faecalis A15（后来被重新鉴定为Pseudomonas stutzeri）的nirS基因序列相似。

典型对虾养殖水体中参与硝化与反硝化过程的微生物群落结构

【目的】本研究旨在分析典型虾塘养殖水体中参与氮循环关键过程的菌群多样性,为指导实际对虾养殖水体中NH 4+和NO 2-的微生物降解、水体氮素污染控制以及虾塘养殖氮素循环的有效管理提供科学依据。【方法】使用聚合酶链式反应及变性梯度凝胶电泳技术(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient GelElectrophoresis,PCR-DGGE)从8个不同地点的虾塘水样中确定代表性水样,以此为典型水样进行研究,构建了氨单加氧酶基因(amoA)、亚硝酸盐氧化还原酶基因(nxrA)、亚硝酸盐还原酶基因(nirS)的克隆文库。利用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术将克隆文库进行酶切分析。【结果】通过序列多态性分析,表明amoA基因克隆文库中所有序列都属于变形杆菌门β亚纲(β-Proteobacteria),分别为亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas)(81%)和亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)(19%)2个属。nxrA基因克隆文库检测到α-Proteobacteria和δ-Proteobacteria两个亚纲,其中硝化杆菌属(Nitrobacter)是优势菌群,占整个文库的92%,仅有一个类群属于δ亚纲的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)(8%)。nirS基因文库群落结构相对于amoA和nxrA基因文库较复杂,分别为α-Proteobacteria、β-Proteobacteria亚纲和Actinobacteria,序列分析表明,25%的类群为固氮弧菌属(Azoarcus),25%的类群为(Polymorphum),20%的类群为需氧去氮菌属(Thauera),10%的类群为(Sophophora),10%的的类群为链霉菌属(Streptomyces),5%的类群为(Brachymonas),5%的类群为(Ruegeria)。【结论】典型虾塘养殖水环境中氮素循环关键过程的菌群多样性丰富,其中亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和硝化杆菌属(Nitrobacter)分别是此环境中主要的氨氧化作用推动者和亚硝酸盐氧化作用推动者,而在反硝化重要环节中,固氮弧菌属等多种菌群都起着推动作用。