目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联...目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。展开更多
目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方...目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。展开更多
文摘目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。
文摘目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。
