应用亚硫酸氢盐修饰后PCR联合TA克隆测序对E-cadherin启动子区甲基化水平的检测

E-cadherin是一种细胞粘附因子,通过增强细胞之间的粘附而起到抑制肿瘤转移的作用.Ecadherin基因启动子区的高甲基化是导致其在众多肿瘤细胞中表达下调甚至缺失的主要原因之一.本实验首先抽提SGC-7901细胞(胃腺癌细胞)、A549细胞(肺腺癌细胞)、MCF-7细胞(乳腺癌细胞)等3个肿瘤细胞株的全基因组DNA,然后对抽提的DNA进行亚硫酸氢盐修饰和纯化回收,根据修饰后的DNA序列设计引物并对其进行PCR扩增.然后将PCR扩增产物与pUC-T TA载体连接并转化入感受态大肠杆菌DH5α中进行培养,对筛选出的含有阳性重组子的菌落进行测序.测序结果显示,3个肿瘤细胞株的E-cadherin基因启动子区的CpG岛都呈现了高度的甲基化,亚硫酸氢盐的修饰效率达到了99.2%.综上研究表明,亚硫酸氢盐修饰后PCR(BSP)联合TA克隆测序可以对肿瘤细胞某基因启动子区CpG岛的甲基化水平进行精确量化,研究所使用的3个肿瘤细胞株均可作为研究肿瘤细胞E-cadherin基因甲基化的细胞模型.

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果 改良法对于低至15、625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。

乳腺癌组织中整体m6A修饰水平与YTHDF3基因的表达

目的探讨乳腺癌组织中mRNA整体N6-甲基腺苷(m6A)修饰水平和甲基化阅读蛋白关键基因YTHDF3基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达。方法通过生物信息学对YTHDF3基因在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达差异及乳腺癌患者生存率进行分析;收集乳腺外科手术切除的25例乳腺癌组织和20例癌旁组织(作为对照),利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法分析乳腺癌组织与癌旁组织组中mRNA的整体甲基化水平,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot实验检测YTHDF3基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的相对表达量。结果生物信息数据库结果显示,YTHDF3基因在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.001),与癌旁组织比较,YTHDF3基因只有在和81~100岁年龄段表达差异具有统计学意义(P<0.05),乳腺癌旁组织中YTHDF3基因的表达量明显低于Luminal分型的乳腺癌(P<0.01),利用受试者工作特征(ROC)曲线验证乳腺癌5年生存率和10年生存率曲线下面积(AUC)>0.56、0.60,高表达YTHDF3基因的乳腺癌患者比低表达的患者存活率低((P<0.05);LC-MS/MS结果显示,乳腺癌分子分型中Luminal型的mRNA的整体甲基化水平高于癌旁组织、差异有统计学意义(P<0.05),HER-2过表达型(HER-2 positive)与癌旁组织的整体甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05);qPCR检测结果显示,YTHDF3基因的表达量在乳腺癌分子Luminal亚型、HER-2 positive亚型中均高于癌旁组织(P<0.05);Western blot结果显示,乳腺癌中YTHDF3蛋白水平高于癌旁组织(P<0.05)。结论乳腺癌组织中mRNA的甲基化水平高于癌旁组织,并且甲基化阅读蛋白关键基因YTHDF3基因在乳腺癌组织中表达上调。

耐热Taq DNA聚合酶的酸酐修饰及其在降低PCR非特异性扩增中的应用评价

酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰TaqDNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落,聚合酶得以恢复正常的扩增活性,从而实现PCR反应的热启动。由此建立的热启动PCR体系灵敏度高,可以检测到10个拷贝的DNA分子,较普通PCR体系提高了2个数量级。此方法较其他方法操作简单成本低廉,且所得的热启动TaqDNA聚合酶稳定性好,便于保存,其灵敏性与特异性也更高。这种通过化学修饰形成的复合物达到热启动PCR目的的方法的建立,具有着重要的意义,是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一。

利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因

市场上的转基因产品以及深加工产品越来越多,其安全性引起全世界的极大争论,很多国家的检验检疫机构相继开展了转基因产品的检测工作。本文以转基因大豆类食品为材料,以聚合酶链式反应(PCR)方法为基础,选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术,针对抗除草剂Round up Ready(RR)大豆的插入基因进行PCR检测,建立适合转基因大豆类食品的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。

人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法检测GSTP1基因多态性

目的建立人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法检测GSTP1第105个密码子基因多态性的方法,并利用该法研究GSTP1第105个密码子在广西百色市人群遗传特征,为进一步研究GSTP1基因多态性与疾病的发生易感性研究奠定基础。方法采用人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法技术对211例广西百色市健康成人进行GSTP1 Ile105Val基因分型,并分析是否存在性别差异及与国内外其他人群分布频率差异。结果人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法GSTP1基因型检测结果与PCR产物测序结果一致,用此法检测出广西百色市女性和男性人群GSTP1 Ile105Val均以A等位基因为主,分别为79.7%和84.5%;AA野生纯合子型、AG杂合子型和GG突变纯合型在女性人群中分别为62.2%、35.1%和2.7%,男性人群则为71.0%、27.0%和2.0%。经统计学分析,广西GSTP1Ile105Val等位基因和基因型分布频率无性别差异,与辽宁、回族、印度、俄罗斯族等人群相应位点基因型分布频率无差异,但与国内维族、朝鲜族、蒙古族、高加索女性相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法是一种快捷、准确的基因多态性检测方法。广西人群GSTP1基因Ile105Val呈多态性分布,基因型分布频率无性别差异,与其他部分种族存在差异。

利用PCR对PVX外壳蛋白基因进行同义密码子修饰

利用聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction ,PCR)与限制性内切酶相结合的方法 ,设计 4条含有限制性酶切位点和相应突变的引物。以马铃薯X病毒 (PotatoVirusX ,PVX)外壳蛋白cp基因为模板 ,扩增出相应的片段 ,相应酶切后通过三片段连接构建到克隆载体pBlueKS(+/ - )上。随机挑选重组子测序表明 ,利用三片段拼接成功地在PVX外壳蛋白基因的不同部位产生了突变。实验结果说明利用三片段接可以大大提高筛选得到突变子的效率 ,从而节省人力、物力和时间。

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。

硫酸化淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-2和IFN-γ的mRNA表达的影响

促进淋巴细胞分泌抗病毒干扰素和白介素等细胞因子是生物活性多糖抗病毒和增强免疫的机制之一。为探明sEPS5和sEPS2抗病毒和增强免疫作用的机理,用Primer Premier软件设计了1对白介素-2(Interleukin-2,IL-2)引物和1对干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)引物,用荧光定量PCR方法测定sEPS2和sEPS5对鸡外周血T淋巴细胞IL-2、IFN-γ的mRNA表达的影响,以未修饰的EPS为对照。结果表明,在62.50μg/ml和31.25μg/ml时,sEPS5和sEPS2对2种细胞因子的诱生作用显著强于未修饰的EPS,其中sEPS5的作用最强,sEPS2次之,并与剂量呈正相关。这可能是硫酸化多糖抗病毒和增强免疫的分子机制之一。

基因修饰食品的检测方法

介绍了基因修饰食品定义、特点以及可能存在的安全问题 ,概述了基因修饰食品检测的策略和方法的研究发展情况 ,阐述了基因修饰食品的检测方法和技术 ,特别是PCR技术的关键问题 ,介绍了几种具体基因修饰食品的检测技术。

重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体

前期通过染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）筛选出了转录因子activator protein．2 alpha（AP-2α）的靶基因Sumf1．采用重叠延伸PCR定点诱变技术，对AP．2α在Sumf1内含子片段上的两个结合位点的碱基进行定点突变，并构建定点突变表达载体．DNA测序表明，Sumf1内含子片段103—111bp，411～419bp两处的碱基已分别由GCCGTCAGG突变为GAAGTCCTG，由GCCTCTAGG突变为GGATCTCTG，成功实现定点诱变，为进一步研究AP-2α对基因Sumf1的表达调控奠定了基础．

浙江丽水铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因研究

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况。方法对临床分离的40株铜绿假单胞菌采用聚合酶链反应(PCR)检测基因[aac(3)-II、aac(6′)-I、aac(6′)-II、ant(3")-I、ant(2")-I]。结果40株菌中aac(6′)-I阳性18株(45.0%)、ant(2")-I阳性21株(52.5%),其余基因均阴性。结论丽水临床分离的铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因携带率高。

福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法的建立及应用

目的建立福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法。方法根据福氏志贺菌4av和Yv血清型O抗结构,针对O抗合成基因wzx、IV型抗原决定基因gtrIV和MASF IV-1抗原决定基因opt,建立血清型4av和Yv的PCR鉴定方法。并应用该方法对126株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测。结果建立了一种福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,在一个反应中包括4对引物,Yv血清型PCR扩增为wzx及opt阳性;4av血清型PCR扩增为wzx、opt及gtrIV阳性。该方法可将4av和Yv血清型与目前已知的其他福氏志贺菌血清型完全区分。对126株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法具有很好的特异性。结论本研究建立的福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,可以用于志贺菌检测和监测。

用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血热点突变

目的用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血基因热点突变。方法选取已知中国人群β珠蛋白基因CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26热点突变位点为检测靶点,分别设计3'末端与野生型基因位点或突变型基因位点完全配对的引物,并用硫化磷酸修饰,进行高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应。用多重PCR反应体系检测临床已知分别含CD26和TATAbox-28突变热点患者的DNA标本。结果对野生模板而言,仅有野生型等位基因相关引物有产物产生,而突变型等位基因位点特异性引物无产物产生。反之,使用突变模板,仅突变型等位基因位点相关引物有产物产生,而野生型等位基因位点特异性引物无产物产生。高保真DNA聚合酶介导的多重引物延伸反应筛查含有CD26或TATAbox-28突变的患者DNA标本时显示,突变引物混合物只有相应突变位点的产物产生,而野生引物混合物则有除突变位点以外的其他5个位点的产物产生。结论建立了基于高保真DNA聚合酶的筛查β地中海贫血基因热点突变的PCR技术。

一种可消除非特异性条带高精度、多用途的PCR方法

目的 建立一种可消除RT-PCR反应中非特异条带生成，提高PCR反应的精确度的PCR体系。方法 比较普通RT-PCR反应与硫化修饰引物结合不同校正活性聚合酶对非特异性扩增的抑制能力。结果 引物3′末端硫化修饰结合具有校正活性的聚合酶可特异性关闭PCR反应中引物3′末端与模板非特异结合而引起的非特异性扩增，只允许引物3′末端与模板完全匹配的延伸反应得以进行。结论 利用校正聚合酶是严格模板依赖型校正活性酶的特点，将引物3′末端硫化修饰后，由于校正聚合酶在PCR延伸开始之前首先会依据模板检查引物是否完全与模板匹配，如果不匹配则将根据模板先将引物修改得和模板一致后才允许延伸的特性，而引物3′端引入抗酶切的硫化修饰后，引物与模板非特异结合将由于校正活性聚合酶长期停留在试图纠正引物与模板不一致状态而得不到有效延伸，从而只允许引物与模板完全匹配的延伸得以扩增，大大提高了PCR反应的特异性。

应用PCR定点诱变技术修正水蛭素Ⅲ(HV_3)化学合成基因

对水蛭素 (HV3 )化学合成基因克隆 No.4 2测序发现其编码区 12 5位碱基胞嘧啶 C缺失 ,采用 PCR定点诱变技术插入了缺失碱基胞嘧啶 C,恢复了正确阅读框架。修正基因经测序鉴定 ,其序列与设计的完全一致。

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的:对H5N1亚型禽流感病毒株(A Qa ST85201)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法:用RT PCR方法扩增A Qa ST85201的ns1基因,之后以扩增产物为模板,采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰,将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中,并将其克隆到真核表达载体,构建pcDNA3.1ns1重组质粒。结果:RT PCR产物测序显示,A Qa ST85201ns1基因开放阅读框全长678bp,编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论:成功将缺失的15个核苷酸片段引入A Qa ST85201的ns1基因中,重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因分布研究

目的明确浙江湖州解放军第98医院临床分离的耐β内酰胺类抗生素鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合酶基因(int Ⅰ 1)及氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside-modifying enzymes,AMEs)基因分布状况。方法采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析 int Ⅰ 1及6种 AMEs 基因 aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅲ、aac(6′)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ和 aph(3′)-Ⅵ。结果鲍曼不动杆菌对头孢噻吩完全耐药,亚胺培南、美洛培南及氨基糖苷类耐药率分别为1.7%、1.7%和86.7%。60株菌中,int Ⅰ 1、aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ和 aph(3′)-Ⅵ基因 PCR 扩增阳性株数(%)分别为35(58.3%)、31(51.7%)、33(55.0%)、36(60.0%)、12(20.0%)和2(3.3%),aac(3)-Ⅲ均阴性。结论解放军第98医院临床分离的耐β内酰胺类鲍曼不动杆菌多重耐药严重,int Ⅰ 1及 AMEs 基因携带率均较高。