蛋白激酶C活性、亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药性的相关研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)活性、亚细胞分布与KBV200细胞株多药耐药(MDR)的关系。方法MTT法检测KB和KBV200细胞对细胞毒药物的耐药性,32P掺入法检测两株细胞的PKC活性。结果长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)对KBV200细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别是KB细胞的65.03和19.8倍;KBV200细胞的膜组分、胞质组分的PKC活性均高于KB细胞(P<0.01),KBV200细胞PKC总活性是KB细胞的2.12倍;佛波酯可升高KBV200细胞总或膜组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值升高(P<0.01);十字孢碱可降低KBV200细胞两种组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值降低(P<0.01),对VCR、ADR的逆转倍数分别是5.46和1.96倍。结论PKC与KBV200细胞株的MDR表型关系密切,PKC可能介导了KBV200细胞的MDR。

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位。方法采用激光共聚焦显微镜观察GRP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78cDNA序列,构建真核表达载体pcDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位。结果GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布。双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白。结论正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达。pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具。

人类新基因RNF122的克隆、表达和亚细胞定位

目的:克隆了一个未知功能的人类新基因RNF122,分析了它的表达谱和细胞定位,为其功能研究提供基础。方法:利用Refseq数据库的序列资料,从人混合组织文库中通过PCR和DNA测序克隆了全长的RNF122,通过生物信息学分析RNF122的结构特性。用Northernblot,RTPCR等方法研究了RNF122在正常组织、肿瘤组织、细胞系中的表达情况。应用共聚焦显微镜分析了它在细胞中的亚细胞定位。结果:获得RNF122全长编码区序列,并构建了绿色荧光蛋白表达质粒。生物信息学分析显示RNF122编码的蛋白中有一个典型的RING结构域。Northernblot和RTPCR证明RNF122在多种正常组织、肿瘤组织和细胞系中都有表达。激光共聚焦显微镜提示RNF122编码蛋白在细胞中定位于高尔基体和内质网。结论:RNF122是一个新的编码含有RING结构域的新基因,它广泛表达于多种组织和细胞系,它编码的蛋白产物定位于高尔基体和内质网中,其可能参与了细胞内蛋白的降解过程。

肿瘤靶向细胞穿膜肽的设计合成及活性检测

目的合成一种可活化细胞穿膜肽(ACPPs)并初步探索其穿膜活性及亚细胞分布。方法应用化学合成方法合成ACPPs,采用流式细胞仪检测ACPPs穿膜活性,免疫荧光法及全波长酶标仪检测表达ACPPs的肿瘤靶向性穿膜作用,用荧光显微镜观察ACPPs在细胞内的定位及ACPPs-pc-Ad.egfp复合物的亚细胞分布。结果成功合成了ACPPs,ACPPs-异硫氰酸荧光素(FITC)组较牛血清清蛋白-FITC组荧光量大,差异有统计学意义(F=4 656.600,P=0.000),ACPPs具有肿瘤靶向性穿膜活性,人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞SW480、人卵巢癌细胞OVCAR3细胞质内荧光量较人支气管上皮细胞HBE大,差异有统计学意义(F=37 947.676,P=0.000);ACPPs定位于细胞质并介导ACPPs-pc-Ad.egfp复合物分布于细胞质。结论成功合成了ACPPs,ACPPs具有肿瘤靶向性穿膜活性并分布于细胞质。

不同辐照度下高浓度锰对黄瓜叶片活性氧产生和抗氧化酶活性的影响

高浓度锰处理提高了黄瓜叶片中H2O2含量和O-2·的产生速率,导致膜脂过氧化;与自然辐照度相比,1/2辐照度使高浓度锰胁迫下黄瓜叶片活性氧和丙二醛(MDA)的积累均显著降低。高浓度锰处理导致细胞溶质和叶绿体中过氧化氢酶(CAT)活性降低,而其他抗氧化酶的活性升高,尤其是自然辐照度下叶绿体中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的提高幅度比1/2辐照度下更大。高浓度锰处理使自然辐照度下线粒体中抗氧化酶的活性明显升高,而在1/2辐照度下该处理对该酶活性没有显著影响。

大负荷运动过程中的心肌钙代谢

学术背景:研究表明,心肌细胞内钙急剧增多与心脏结构功能的损伤有重要关系。机体完成长时间剧烈运动时,心脏等其他内脏系统主动发生缺血缺氧,以满足运动器官的血液供应,而心肌由于缺氧复氧出现钙超载。目的:总结大负荷运动对心肌细胞钙代谢影响的研究进展。检索策略:应用计算机检索Sportdiscussl981-01/2007-11有关大负荷运动影响心肌钙代谢的文章,检索词"Exercise,Myocardial,cytoplasm,cell nuclear,Sarcoplasmic ret-iculum,mitochondria,calcium",限定文章语言种类为"English",文章来源限定为"Journals article";计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2007-11期间的相关文章,检索词"运动;心肌;细胞浆;肌浆网;线粒体;细胞核;钙",限定文章语言种类为中文;同时手工查阅相关书籍。共检索到60篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与大负荷运动对心肌钙代谢的影响密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:重复性研究。文献评价:文献的来源主要是大负荷运动对心肌钙代谢影响方面的随即对照实验。所选用的30篇文献中,6篇为综述,其余均为基础实验研究。资料综合:①心肌细胞内钙的稳定主要由细胞膜、肌浆网以及线粒体来调节。②大负荷运动会引起机体心脏发生缺血再灌注,从而影响心肌细胞膜与肌浆网对钙的正常转运,细胞外钙内流增多而胞浆内钙泵出减少,同时肌浆网摄钙能力下降,胞浆内钙离子浓度急剧升高。③大负荷运动由于引起心肌细胞浆内的钙离子过度升高,线粒体通过其膜上的单向转运机制摄取胞浆内过多的Ca2+离子而缓解细胞浆内钙超载,从而造成自身的钙超载,表现为线粒体内钙盐沉积,总钙增多,而基质游离钙浓度却下降。结论:大负荷运动可导致心肌细胞钙代谢紊乱,出现钙超载。有关运动性缺氧复氧对心肌钙代谢影响的研究已取得一些进展,但还不够深入,还存在一些空白。

肝癌组织中多种自体吞噬的形态测量学分析

目的调查不同类型自体吞噬在肝癌及癌旁组织中的分布情况。方法通过电子显微镜观察15对肝癌组织标本的超微结构,并使用相关软件量化图像指标以分析不同类型自体吞噬分布与细胞超微结构特征之间的联系。结果数据提示肝癌细胞中主要分布巨型自噬,分布与肿瘤细胞的活动及代谢情况相关;而癌旁细胞主要分布微型自噬,且分布与细胞的炎症损伤程度相关。结论巨型自体吞噬和微型自体吞噬在肝细胞癌组织及癌旁组织中呈现不对称分布,该现象可能与肝癌的发生相关。

奶牛乳腺组织亚细胞组分的双向凝胶电泳分析

利用超速离心结合梯度离心法分离亚细胞组分的技术路线,以提高奶牛乳腺组织蛋白双向凝胶电泳的分离效率。奶牛乳腺组织液氮研磨破碎后,差速离心分离成细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体4个亚细胞组分,Nyco-denz纯化,2-DE分离蛋白,PDQUest8.0软件分析凝胶图谱。结果显示,奶牛乳腺组织细胞经亚细胞分离后,电泳分辨率大大提高,特别是细胞核蛋白质检出效率明显提高。不同亚细胞蛋白质组电泳图谱的差异显示了其蛋白质组构成的不同。由此可见超速离心结合梯度离心是一种有效的奶牛乳腺亚细胞组分分离手段,亚细胞蛋白质组学克服了蛋白质组的一些缺陷并可将蛋白质组研究引向亚细胞水平。

二羰基/L-木酮糖还原酶单克隆抗体的鉴定与应用

目的:抗人二羰基/L-木酮糖还原酶(dicarbonyl/L-xylulose reductase,DCXR)的单克隆抗体(mAb)的初步鉴定与应用。方法:通过免疫荧光染色法对DCXR mAb进行亚细胞定位,通过免疫沉淀法对DCXR mAb进行初步应用研究。结果:DCXR mAb定位于肝脏的线粒体,通过免疫沉淀法该mAb可以从线粒体总蛋白中去除相应的蛋白DCXR。结论:成功制备了抗人DCXR的mAb,为DCXR的研究提供了有力的工具。

膀胱癌间质蛋白质表达谱及转移潜能评价分析

目的使用放射性核素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ法)分析不同转移潜能浸润性膀胱癌间质蛋白的表达谱特征,并与尿液中蛋白质表达谱进行对比,探讨从尿液中建立肿瘤生物标记组用于评价膀胱癌转移潜能的可能性。方法首先应用激光捕获显微切割技术(LCM),获取纯化的高、中、低危组肿瘤细胞标本,然后根据iTRAQ法分别鉴定高、中、低转移风险浸润性膀胱癌细胞蛋白质表达谱,并分析其差异表达。结果 3组肿瘤细胞标本中有943个蛋白共同表达,根据基因本体论进一步分析表明,943个蛋白质中具有生物学途径、细胞成分注解的蛋白质分别为760、804个。通过与国际蛋白质索引的完整列表进行对比,生物学途径中浓集-缺失的分支术语为55/11,细胞成分中浓集-缺失的分支术语为43/8。结论 LCM联合iTRAQ法分析不同转移潜能浸润性膀胱癌间质蛋白的表达谱特征,结果可靠、有效;细胞的生物学途径和亚细胞结构决定膀胱转移潜能。