不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长的影响

【目的】探索不同碳源对耐热型解脂亚罗酵母生长及产赤藓糖醇的影响,通过优化碳源组合提升耐热型解脂亚罗酵母的赤藓糖醇产量。【方法】分别以30、34、38℃条件下生长的解脂亚罗酵母CA20、解脂亚罗酵母HT34和解脂亚罗酵母HT38为研究对象,利用含有不同碳源的培养基进行培养。培养过程中每隔24 h取样,采用酶标仪检测菌液在600 nm处的光密度值(optical density, OD_(600))。培养液中赤藓糖醇和葡萄糖质量浓度采用高效液相色谱(HPLC)检测。【结果】菌株CA20能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇、甘油、可溶性淀粉和大豆油脂等碳源,其中葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、甘油和大豆油脂为最优碳源;菌株HT34对除葡萄糖和果糖以外碳源的利用能力下降,而菌株HT38几乎不能利用除葡萄糖和大豆油脂以外的碳源;培养基中同时添加葡萄糖和另一种碳源对菌株CA20生长的影响较小,而同时添加葡萄糖和大豆油脂可明显促进菌株HT34和HT38的生长。此外,大豆油脂可显著提升菌株HT34和HT38的赤藓糖醇产量和得率,增加量最高可达50%左右。【结论】本研究结果为今后利用高温发酵生产赤藓糖醇提供了理论依据。

响应面法优化解脂亚罗酵母产菜油甾醇培养基组成

为提高解脂亚罗酵母PMEDD菌株菜油甾醇的产量,对此菌株发酵培养基组成进行了优化。采用单因素实验探究碳源种类、氮源种类、碳源质量浓度、氮源质量浓度、KH2PO4质量浓度对菜油甾醇产量的影响。在此基础上,采用响应面实验对发酵培养基组成进行了优化。结果表明:培养基组成为葡萄糖3.17 g/100 mL,蛋白胨1.44 g/100 mL,KH2PO40.65 g/100 mL,Uracil 0.1 g/100 mL,YNB 0.42 g/100 mL,MgSO4·7H2O 0.15 g/100 mL时,菜油甾醇的产量达到最大,为16.49μg/mL,优化后菜油甾醇的产量为优化前的2.10倍。采用优化后的培养基,可有效提高解脂亚罗酵母PMEDD菌株菜油甾醇的产量。

基于比较基因组学的解脂亚罗酵母CA20高产赤藓糖醇机理及进化分析

解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)是赤藓糖醇生产中使用的主要菌种,复合诱变是选育优良菌株的常用方法。然而,诱变处理所引起的基因组变化尚待探索。本研究对前期获得的高产菌株CA20和原始菌株WT5进行基因组测序,并与已发布的8株解脂亚罗酵母进行比较基因组分析,旨在探究菌株CA20高产赤藓糖醇的机理以及不同菌株的基因组进化关系。结果显示,菌株CA20基因组大小为20,420,510 bp,GC碱基含量为48.97%,编码6330个CDS和649个ncRNA,菌株CA20和其他8株菌高度同源,平均核苷酸同源性(average nucleotide identity,ANI)>99.50%,其中与菌株IBT 446和H222具有更近的亲缘关系。比较基因组分析显示,CA20和其他8株菌共有5342个核心基因,而CA20特有的65个基因主要参与物质跨膜运输和蛋白质转运过程。CA20基因组中含有166个碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)基因,远多于其他菌株(108~137个),包括特有的4个糖苷水解酶类(glycoside hydrolases,GHs)、2个糖基转移酶类(glycosyltransferases,GTs)和13个碳水化合物酯酶类(carbohydrate esterases,CEs)。除转醛酶TAL1外,赤藓糖醇代谢途径有关酶在不同菌株中高度保守。此外,菌株CA20的赤藓糖醇产量和产率为190.97 g/L和1.33 g/L/h,显著高于WT5的128.61 g/L和0.92 g/L/h(P<0.001)。相比于WT5,CA20中5个基因发生移码变异,15个基因存在非同义突变位点,这些基因主要参与细胞分裂、细胞壁合成、蛋白质合成及稳态维持等过程。以上结果表明,解脂亚罗酵母基因组在进化过程中保守;生存环境不同是导致菌株间基因组差异的重要因素;基因组中CAZymes数量的差异是不同菌株间性能差异的原因之一;菌株CA20高产赤藓糖醇与其细胞结构及内环境稳定性的提升有关。本研究结果为赤藓糖醇高产菌株的定向选育提供基础。

解脂亚罗酵母赤藓糖醇发酵过程的研究

从自然界分离得到1株可发酵葡萄糖为赤藓糖醇的酵母菌Y-22。经鉴定,属于解脂亚罗酵母。该酵母菌在高糖条件下转化赤藓糖醇的能力比众多从国内保藏机构获得和自然界分离得到的同种、异种酵母及未鉴定耐渗酵母高很多。在5 m3和50 m3容量的发酵罐上进行发酵试验,对葡萄糖的转化率可以达到47%,赤藓糖醇在96 h内可达150 g/L以上。文中还对赤藓糖醇的分批发酵和流加发酵过程进行了讨论。

解脂亚罗酵母Y-2对葡萄采后病害及赭曲霉毒素A的控制作用

解脂亚罗酵母Y-2是在本实验室筛选的1株能够在体外降解赭曲霉毒素A(OTA)的酵母菌。本文研究其对不同品种葡萄由微皱篮状菌O1引起的采后病害及OTA积累的控制作用。不同浓度解脂亚罗酵母Y-2对红提葡萄采后病害和OTA积累的控制作用以及葡萄贮藏期间其对采后病害和OTA积累的控制作用。研究结果表明,解脂亚罗酵母Y-2对不同品种葡萄由微皱篮状菌O1引起的采后病害均有显著的控制效果,能显著降低红提葡萄伤口处OTA的积累。与对照相比,解脂亚罗酵母Y-2处理的夏黑、巨峰和红提葡萄的腐烂直径分别降低了28.7%,19.7%和18.5%,红提葡萄伤口处OTA的积累量降低了83.3%。随着酵母浓度的升高,解脂亚罗酵母Y-2对红提葡萄采后病害和OTA的控制效果增强,当酵母浓度为1×108细胞/mL时,腐烂直径降低了23.8%,OTA积累量由50 ng/伤口,降到5.95 ng/伤口。在整个贮藏过程中,解脂亚罗酵母Y-2对红提葡萄采后病害和OTA的积累均有显著的控制效果。

解脂亚罗酵母对棒曲霉素降解条件的筛选及部分机理研究

通过解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)与棒曲霉素(patulin, pat)共培养,用高效液相色谱法(HPLC)测定棒曲霉素含量,研究该酵母对棒曲霉素的去除效果,用响应面法筛选最佳脱毒条件,并初步探讨脱毒机制。结果表明,Y.lipolytica能有效脱除棒曲霉素,脱毒效果受温度、pH值、棒曲霉素及酵母初始浓度和酵母活性的影响。在pH值4.6、温度27.5℃和酵母初始浓度1×10^(10) CFU/mL条件下,该酵母对棒曲霉素降解效果最佳,脱毒率可达100%。棒曲霉素对Y.lipolytica的生长具有一定的抑制,但整体抑制程度不大。棒曲霉素初始浓度越高,酵母的脱毒率就越低。酵母初始浓度越高,酵母的脱毒效果越好。活酵母对棒曲霉素的脱毒效果显著高于热致死酵母。此外,酵母胞内物质对棒曲霉素有显著的脱毒作用,而培养上清液对棒曲霉素没有作用。综上所述,Y.lipolytica可有效去除棒曲霉素,生物降解是其主要的作用机制。

重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇

菜油甾醇是一种具有重要生理活性的植物甾醇。为构建合成菜油甾醇的工程菌株,通过敲除解脂亚罗酵母polf菌株中麦角固醇合成基因ERG5,促进麦角-5,7,24-三烯醇的体内积累,进而表达经密码子优化的非洲爪蟾DHCR7基因,使麦角-5,7,24-三烯醇在DHCR7和polf胞内ERG4的共同催化作用下,转化成菜油甾醇,最后利用GC-MS对重组菌株的发酵产物进行检测分析。结果表明,重组菌株polf-ERG5--DHCR7+(PED)合成菜油甾醇的产量达0.485 mg/g(以细胞干重计)。重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇菌株的成功构建,为生物合成法合成植物甾醇提供了新思路。

高产赤藓糖醇解脂亚罗酵母变异株的代谢酶和线粒体DNA变化

解脂亚罗酵母E4-2是赤藓糖醇发酵原始菌株Y-22的高产突变株,可以在350 m^3发酵罐上以96 h的发酵周期产生19.3 g/100mL的赤藓糖醇,对葡萄糖的转化率达到56%,比原始菌株提高约20%。对6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)酶及赤藓糖还原酶(ER)酶活力的测定未表现出明显的变化。对线粒体DNA的RAPD的比较分析结果表明,其线粒体DNA的结构发生了显著的变化,故推测此变化是其发酵性状改变的主要原因。

外源基因表达对解脂亚罗酵母糖醇代谢影响的初步研究

解脂亚罗酵母是重要的真核表达宿主,也是当前国内赤藓糖醇发酵的主流菌种。该文将克隆异源酵母中提取的一个推定具有糖磷酸化功能的基因,通过构建表达载体并转入解脂亚罗酵母中进行表达,考察重组菌株与赤藓糖醇合成相关底物利用和转化的影响。结果显示,解脂亚罗酵母重组菌株与亲本菌株相比在摇瓶发酵实验中对赤藓糖醇和核糖的同化存在差异性,重组菌株在基质中含有葡萄糖和赤藓糖醇或核糖时,同化能力至少为亲本菌株的2倍,该功能基因为具有赤藓糖醇合成调控能力的新基因;将重组菌株用于赤藓糖醇母液的处理试验表明,重组菌株与对照菌株相比可同化母液中的多种糖醇用于细胞的生长,能改变结晶母液组分降低母液黏度和麦芽糖浓度,为工业废液的综合利用提供了新的解决方案。

解脂亚罗酵母中HMGR基因的生物信息学分析及催化域部分表达

对解脂亚罗酵母中甲羟戊酸途径的限速酶HMGR进行了生物信息学分析,克隆其活性结构域(tHMG,第441~875位氨基酸),并与标记分子GFP共表达。生物信息学分析表明,HMGR基因可编码一个含有999个氨基酸的疏水性不稳定蛋白,该蛋白前500个氨基酸肽链含有较多的跨膜区,其理论分子量和等电点分别为254.93kDa和4.77;活性结构域包含506个氨基酸,理论分子量和等电点分别为127.74kDa和4.93,不含跨膜区。两个蛋白的二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,三级结构均以同源四聚体的状态存在。在激发光(488nm)下观察融合表达tHMGGFP的酵母细胞,发现产生绿色荧光。经测定解脂亚罗酵母超表达催化域(tHMG)后,酶比活为1.14U/mg,比对照组提高了62.7%,此结果说明HMGR催化域部分可以独立表达,提高细胞内的HMGR酶活水平。

解脂亚罗酵母原生质体的制备与再生条件

使用纤维素酶和蜗牛酶复合酶液进行处理,并用β-巯基乙醇预处理,采用甘露醇作为渗透压稳定剂,考察菌龄、酶质量浓度、酶解温度和酶解时间对解脂亚罗酵母原生质体形成和再生的影响。实验得出结论:对于原生质体形成率影响因素来说,理论的最佳形成条件为:菌龄36 h,酶质量浓度为2.5mg/m L,酶解温度为25℃,酶解时间为8 h;对于原生质体再生率影响因素来说,理论的最佳再生条件为:菌龄48 h,酶质量浓度为2 mg/mL,酶解温度为25℃,酶解时间为8 h。而综合形成率和再生率共同影响因素顺序为:菌龄>酶质量浓度>酶解温度>酶解时间,最佳制备条件为:菌龄36 h,酶质量浓度2mg/mL,酶解温度25℃,酶解时间8 h。

解脂亚罗酵母P12单倍体的制备

【背景】目前解脂亚罗酵母在实验研究和工业生产方面的应用越来越广泛,但相较于常规酵母而言,解脂亚罗酵母缺乏简便有效的遗传转化体系,致使其在基因表达调控方面存在较大困难。同时,酵母的染色体倍性也会对基因敲除效果产生影响,选择单倍体细胞作为功能基因改造的受体可以避免等位基因之间相互作用的影响,解决多倍体细胞基因敲除不完全的问题。【目的】以解脂亚罗酵母诱变菌株P12为研究对象,以不同方法分离得到单倍体菌株,建立解脂亚罗酵母单倍体的制备方法。【方法】分别采用固体和液体McClary产孢培养基诱导解脂亚罗酵母菌株产生子囊孢子,培养条件为30℃,固体7-14 d;液体200 r/min,2-4 d。以2%浓度的蜗牛酶33℃水浴裂解子囊孢子细胞壁3 h,通过染色镜检和PCR鉴定筛选单倍体细胞。【结果】镜检结果表明,解脂亚罗酵母在液体产孢培养基中产孢速度较快,相同视野下孢子数约为固体产孢培养基的3.7倍,在固体产孢培养基中产孢质量较好。初步探索并筛选得到6株解脂亚罗酵母P12 B型单倍体菌株。【结论】解脂亚罗酵母P12 B型单倍体菌株的获得可为后续继续开展基因工程操作奠定基础。

比较基因组分析Yarrowia lipolytica BBE-17的赤藓糖醇合成机制

Yarrowia lipolytica BBE-17是一种野生型非模式菌,可发酵生产赤藓糖醇,具有潜在的工业应用价值。我们将菌株BBE-17与模式菌株CLIB122进行了比较基因组分析,探究其赤藓糖醇积累的可能机制,揭示了BBE-17中43921个单核苷酸多态性(SNPs),8078个小片段插入和缺失。此外,与参考基因组相比,发现了129个基因组结构变异和142个覆盖六条染色体的DNA拷贝数变异。在这些变异中,与赤藓糖醇合成有关的途径基因只有TKL1和ER,分别发生了1个单核苷酸多态性变化,并且只导致1个氨基酸发生改变,表明这两个基因中的SNP不是造成赤藓糖醇积累的主要原因,而BBE-17中大量的缺失型基因组变化可能是代谢网络改变的主要原因,也可能是靶向代谢途径增强和赤藓糖醇积累的主要原因。在基因组层面全局揭示了BBE-17与CLIB122的差异,探寻其积累赤藓糖醇的机制,为进一步优化改造亚罗解脂酵母生产赤藓糖醇提供了思路和理论依据。

赤藓糖醇微生物合成研究进展

糖的过量摄入给人们的身体健康带来了风险。甜味剂的发现和合理使用有助于减少食品中糖的添加。作为天然甜味剂的赤藓糖醇,因其具有独特的理化性质如热值低、基本不被人体代谢、稳定性高和食用不会引起肠道不适等而受到广泛关注。目前,赤藓糖醇已被广泛用于食品、医药和化工产品中,其国内外市场需求量正逐年提升,这对赤藓糖醇的工业化生产提出了新的挑战。为此,笔者综述了利用微生物发酵合成赤藓糖醇的国内外最新研究概况,包括生产所使用的主要菌种和优良菌种选育策略、以可再生资源为原料合成赤藓糖醇的技术探索,以及菌种的代谢工程改造方案,讨论了提高赤藓糖醇产量的组合策略和路径,以期为今后高产赤藓糖醇菌种的选育和赤藓糖醇的绿色可持续生产提供思路和参考。

低温淀粉酶菌种分离纯化与发酵生产研究

通过对滨州黄河三角洲地区的样品中微生物的采集,经过选择性培养基分离获得了4株产葡萄糖淀粉酶较高的菌株:Bz11、Bz25、Bz38、Bz73,其在20℃可以产生较高活性的淀粉酶,与报道菌株降低10℃左右,经过复筛最终选择产酶相对较高的Bz38作为研究对象,通过平板菌落观察、显微镜细胞观察,碳源发酵与同化试验、26Sr DNA分子生物学鉴定,最终确定Bz38为解脂亚罗酵母菌(Yarrowia lipolytica)。在掌握菌株生长规律的基础上,选择碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇)、氮源(牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素、酪蛋白胨、硫酸铵)单因子、菌株淀粉酶活达到960 U/m L,为全面应用葡萄糖淀粉酶奠定了坚实的力量基础,也极大的丰富了本地区对微生物种质资源的开发和利用。

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析(英文)

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。