铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。[方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。[结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。[结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。

梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族),而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA12家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA12家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA12多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64k Da,表现出亚铁氧化酶(EC1.16.3.1)与漆酶(EC1.10.3.2)双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn^2+、Hg^2+和Pb^2+抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA12家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。