交叉引物恒温扩增技术检测创伤弧菌的应用研究

目的建立一种快速检测创伤弧菌( Vibrio vulnificus )的交叉引物恒温扩增(cross priming amplification,CPA)技术。方法 针对创伤弧菌vvhA基因序列保守区域设计CPA引物和探针,并优化反应体系和反应条件,同时验证方法的灵敏度和特异性。结果 对创伤弧菌的检测具有高度特异性;对创伤弧菌菌液检测的灵敏度达到了1.28×10^3 CFU /mL,此法 40~60 min 内即可完成检测。利用CPA法针对本实验室前期研究的CB型、EA型、CAB型、CA型和EB型等亚型创伤弧菌毒株计算特异性和敏感性,5种亚型中除了CB亚型特异性和敏感性为95.65%和100%,其余亚型特异性和敏感性均为100%。结论 本研究建立的CPA法具有较高的特异性和灵敏性,可有效缩短检验时间提高检验效率。

花鲈虹彩病毒交叉引物恒温扩增检测方法的建立

【目的】花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)严重威胁花鲈养殖业安全,无特效防控药物,早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用。建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法,可为LMIV的基层诊断提供技术支撑。【方法】利用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA),针对LMIV ATPase基因高保守区设计1套单交叉引物。以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板,对反应体系中的引物浓度比,Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO_(4)、dNTP浓度,以及反应温度和反应时间进行优化;结合一次性核酸试纸条,建立可视化检测LMIV-CPA的方法。【结果】最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0μmol/L,引物F3和B3均为0.4μmol/L,探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为0.8μmol/L;MgSO4浓度为6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为0.256 U/μL;最佳反应温度为62℃,最佳反应时间为45 min。扩增产物经凝胶电泳检测呈梯形条带,带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测,在3~5 min内即可通过是否出现特征性条带而使反应结果可视化。该方法可特异性地检测出LMIV,不与其他水生常见病毒和常见细菌发生交叉反应。使用LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测156份临床样品,LMIV-CPA的阳性检出率为93.30%,常规PCR方法的阳性检出率为85.83%;在比较二者的灵敏度差异时,LMIV-CPA的检测限为102 copies/μL,灵敏度为常规PCR的10倍,综合结果显示LMIV-CPA优于PCR。【结论】LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于LMIV的现场快速检测,为花鲈LMIV的准确快速诊断和有效防控提供技术支撑。

交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用

目的探讨交叉引物扩增技术（CPA）快速检测系统在结核病诊断中的价值。方法收集唐山市第四医院2015年3~5月206例结核病就诊患者的痰液标本,其中肺结核患者95例（其中痰涂片阳性26例,阴性69例）,非结核患者111例,分别采用RT-PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测标本中的结核分枝杆菌,对结果进行统计分析。结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT~TB-CPA法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27.37%（26/95）、50.53%（48/95）、56.84%（54/95）、51.58%（49/95）。以罗氏培养结果为诊断金标准,EasyNAT~TB-CPA法灵敏度为89.58%（43/48）,特异度94.94%（150/158）;RT-PCR法的灵敏度为83.33%（40/48）,特异度94.30%（149/158）;EasyNAT~TB-CPA与RT-PCR法相比,总体一致性为98.54%（203/206）,Kappa指数值为0.92。结论 TB-CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值,且方法简便、快速。

交叉引物法恒温扩增技术在结核病诊断中的应用价值分析

目的:探讨在目前的结核病诊断中,交叉引物恒温扩增技术(CPA)的临床应用价值。方法:选取我院接诊疑为肺结核病的初诊患者256例,收集研究对象4份痰标本,分别采用罗氏培养、痰涂片萋尼氏抗酸染色法、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和CPA进行检测,评价各项指标检测阳性率,并以罗氏培养法为标准,判断其灵敏度、特异性。结果:罗氏培养法阳性检出率为40.23%、痰涂片法阳性检出率为27.34%、RT-PCR法阳性检出率为37.89%、TB-CPA法阳性检出率为38.67%。痰涂片法灵敏度为35.29%,特异度为77.92%;RT-PCR法灵敏度为80.39%,特异度为90.26%;TB-CPA法灵敏度为81.55%,特异度为90.20%。结论:CPA在结核病诊断中不仅具有较高准确性,同时操作简单方便,检测时间短,具有较高的临床应用价值。

交叉引物恒温扩增法检测甲型H1N1流感病毒及临床应用

目的建立交叉引物恒温扩增（Cross Priming Amplification,CPA）技术对甲型H1N1流感病毒进行检测的方法,并对该方法通过临床标本进行评价。方法根据甲型H1N1流感病毒的保守序列设计特异性引物,并在同一温度下实现RNA的逆转录和DNA扩增,该扩增产物可通过全封闭式核酸检测装置进行检测。14份健康人咽拭子标本、7个其他呼吸道病毒和6个虫媒病毒株被用来检测CPA反应的特异性;已知病毒滴度的甲型H1N1毒株进行对照梯度稀释,以测试CPA的敏感性;102份甲型H1N1临床咽拭子标本为检测对象,评估其临床的检测的可行性。结果 CPA反应未出现对健康样本以及其他病毒产生交叉反应;对已知滴度的病毒进行梯度稀释检测,证明CPA的敏感性为10拷贝/μL。对甲型H1N1流感临床病例发病1~3d临床标本新建检测方法的检出率为100%,4~6d临床标本检出率为79.31%,≥7d临床标本检出率为9.09%。讨论CPA具有较高的敏感性、特异性,对设备要求低,适合基层医疗单位对甲型H1N1流感发病早期诊断使用。

交叉引物等温扩增技术检测志贺氏菌

建立一种新型志贺氏菌简洁快速检测方法——交叉引物恒温扩增检测方法。针对志贺氏菌的四个血清型设计保守的特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法并应用免疫金标试纸条进行检测。用6株志贺氏菌,32株近源菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、干扰菌试验检测进行灵敏度验证。建立方法具有较好的特异性,增菌液及干扰菌检测灵敏度均为103cfu/mL。建立的交叉引物恒温检测方法灵敏度高,可满足对志贺氏菌进行现场快速筛查目的。

交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌

建立一种新型沙门氏菌快速筛选检测方法--交叉引物恒温扩增检测方法。针对沙门氏菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法进行检测。用19株沙门氏菌,35株近源菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数检测进行灵敏度验证。建立方法具有很好的特异性;增菌液检测灵敏度为102cfu/mL,DNA检测灵敏度为101fg/test。建立的交叉引物恒温检测方法特异性好、灵敏度高,不需要复杂仪器,对口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区顺利开展检测具有实际意义。

交叉引物等温扩增技术在肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的交叉引物等温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)检测方法。方法根据EHEC O157:H7 stx1基因特征性保守序列(Gen Bank83460),设计交叉引物、剥离引物和检测探针,建立了EHEC O157:H7的CPA检测技术。用该方法检测19株细菌常见的食源性细菌,以验证其特异性;并用菌液浓度梯度稀释的方法对该方法的检测灵敏度进行评价。并通过60份食品模拟样品验证其在实际应用中的可性行,该检测结果与经典的细菌分离培养鉴定方法及常用的荧光定量PCR法进行比较。结果在检测的19株细菌中,只有EHEC O157:H7菌株的检测结果为阳性。其它菌株检测结果均为阴性,证明其特异性良好;通过浓度梯度稀释证明该方法检测的灵敏度可达l02cfu/m L;与分离培养鉴定法及荧光定量PCR法比较,其检测的灵敏度均为96.77%和96.67%、特异度分别为93.10%和90%、准确性分别为95%和93.33%。结论用于EHEC O157:H7的CPA检测体系具有简便、快速、灵敏、特异的优点,可用于进出境口岸现场及食品EHEC O157:H7的快速检测。

二代交叉引物恒温扩增技术对结核分枝杆菌检测的应用价值

目的 评估二代交叉引物恒温扩增技术(CPA)对结核分枝杆菌(MTB)检测的应用价值。方法 选取我院收治患者送检的各类标本235例,其中痰液98例、肺泡灌洗液76例、胸(腹)水37例、其它标本(穿刺液及分泌物等)24例。对每份送检标本应用多色巢式荧光定量PCR(Xpert MTB/RIF)和二代CPA同步检测MTB,比较二者检测结果的差异。结果 Xpert MTB/RIF和二代CPA检测MTB的总体阳性率分别为43.38%和42.13%,对痰液、肺泡灌洗液、胸(腹)水、其它标本(穿刺液及分泌物等)的阳性检出率则分别为50.00%与47.96%、47.37%与44.74%、16.22%与16.22%、50.00%与50.00%,二者对各类标本的阳性检出率比较差异均无统计学意义(p>0.05)。二者对全部标本的阳性符合率88.35%,阴性符合率93.94%,总符合率91.49%,一致性比较,Kappa=0.83。二者检测结果的差异主要表现在少数含菌量极低的标本。结论 二代CPA与Xpert MTB/RIF对检测MTB结果比较具有极高的一致性,二代CPA可推荐用于临床对MTB的快速检测。

猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法的建立

拟建立一种简便、快速、准确的现场快速分子检测方法,为猪圆环病毒2型（PCV2）疾病的生物安全防控提供技术支撑。采用交叉引物恒温扩增技术原理,根据PCV2 Cap基因设计一组交叉扩增引物,用构建的Cap基因重组质粒作为标准DNA模板,对反应体系的引物浓度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反应温度和时间进行优化,并结合核酸试纸条技术,建立可视化检测PCV2的交叉引物恒温扩增检测方法（PCV2-CPA）。用建立的CPA检测方法、常规PCR和ELISA方法检测经IFA方法标定的127份临床样品,比较这些方法的敏感性、特异性和符合率。结果显示,最佳反应体系为引物F3、B3各0.5μmol·L-1,CPR 1μmol·L-1,DF5F0.7μmol·L-1、DF5B0.9μmol·L-1,Betaine 0.075mol·L-1,MgSO43mol·L-1,dNTPs 0.4mmol·L-1,Bst DNA聚合酶9.6U。建立的检测方法58℃扩增50min,检测限可达7.6拷贝·μL-1,灵敏度是常规PCR的10倍;与PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV无交叉反应。三种检测方法的敏感性分别为78.08%～94.52%,特异性为87.03%～92.59%,符合率为84.25%～91.34%,ROC曲线图显示三种检测方法中,CPA检测方法效能最优。建立的猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法不需要PCR仪,仅一台水浴锅或金属浴即可完成病毒DNA的扩增,密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,可应用于猪圆环病毒2型的现场快速检测。

交叉引物扩增技术在结核病诊断中的应用

目的探讨交叉引物扩增技术(crossing priming amplification,CPA)在结核病防治中的应用。方法采集2017年5月至2018年3月五常市结核病防治所门诊初诊的疑似肺结核患者的痰标本,按照《WS288—2008肺结核诊断标准》进行诊断,最终纳入267例肺结核患者,64例非结核性肺疾病患者。分别进行痰涂片、痰培养和CPA检测,分析CPA的检测效能。结果331例患者中痰涂片检测阳性66例,阴性265例;痰培养阳性136例,阴性195例;CPA检测阳性137例,阴性194例。以痰培养检查结果为标准,CPA检测的敏感度和特异度分别为98.94%(186/188)、92.31%(132/143)。以临床诊断为标准,痰涂片检查的敏感度和特异度分别为23.97%(64/267)、96.88%(62/64),痰培养检查的敏感度和特异度分别为48.69%(130/267)、90.63%(58/64),CPA检查的敏感度和特异度分别为51.31%(137/267)、96.88%(62/64)。结论CPA是一种新型的结核恒温检测技术,具有操作简单、快速、稳定,检测结核分枝杆菌具有较高的敏感度和特异度,可以明显提高结核病病原学的阳性检出率,适合在县(区)级结核病实验室应用。

交叉引物等温扩增检测猪肉源性成分

肉制品掺假现象已成为我国食品行业重点关注的问题。本研究使用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA)和核酸试纸条检测相结合的方法快速检测肉制品中猪肉成分。对猪线粒体的D-loop基因序列设计特异性的引物和探针,通过优化引物浓度及反应条件,确立最佳反应体系。实验结果表明,CPA扩增系统对猪源性成分的检测特异性良好,对单猪源性成分的检出限为1 ng/μL,对混合肉制品中猪源性成分的检出比例为10%(相当于10 ng/μL)。同时核酸试纸条可以快速检测CPA扩增产物,结果与凝胶电泳系统检测保持一致。本研究建立的CPA-核酸试纸条检测方法是一种特异、高效的肉制品中猪肉成分检测方法,可以为肉制品质量控制提供有效的新手段。

交叉引物等温扩增检测霍乱弧菌方法的建立

建立食品中全血清型霍乱弧菌的交叉引物等温扩增检测方法。针对霍乱弧菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法,利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用57株霍乱弧菌及相近株细菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数、样品中添菌检测及与环介导等温扩增方法进行灵敏度验证及比较工作。结果表明,建立方法具有较好特异性;DNA检测灵敏度为79.28 fg/test,增菌液检测灵敏度为4.2×102CFU/m L,当每25克样品中有5.6 CFU菌时经增菌步骤后即可检出。建立的交叉引物恒温检测方法可作为食品中霍乱弧菌快速初筛检测方法使用,较环介导等温扩增方法灵敏且易于操作。

交叉引物等温扩增技术在EHEC检测中的应用

目的建立一种新型的交叉引物等温扩增技术检测组织中的肠出血性大肠杆菌(EHEC),为临床诊断提供快速、灵敏、有效的检测方法。方法根据EHEC O157:H7的基因特征性保守序列,进行交叉、剥离引物设计之后,采用检测探针来进行O157:H7检测,从而检测出比较常见的食源性细菌并对这些细菌的特异性进行验证,对菌液进行不同浓度稀释,从而对交叉引物等温扩增技术检测的灵敏度进行评估,多次实验验证此方法的实用性。结果检测中,仅O157:H7菌株呈阳性,特异性良好,灵敏度也比较高。结论在EHEC O157:H7进行检测的过程中,应用交叉引物等温扩增技术来进行,操作简单易上手,检测速度比较快,检测灵敏结果准确,特异性比较强,应当广泛应用于肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测实践当中。

交叉引物扩增法快速检测牛病毒性腹泻病毒

[目的]牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种可以引起牛腹泻的病原体,在中国分布广泛,给养牛业造成了巨大损失。快速发现和准确鉴定BVDV对后续管理和流行病学调查至关重要。[方法]本研究以5'UTR基因为靶点,应用交叉引物扩增(CPA)与免疫层析试纸相结合的检测方法对BVDV进行检测。[结果]CPA检测限为每次反应640 fg,温度为62℃,反应时间为60 min。未观察到与牛感染的其他病原体发生交叉反应。此外,使用CPA测定法对100份感染BVDV的现场样本进行准确评估。将CPA与常规PCR检测结果进行比较,结果显示,CPA比常规PCR具有更高的检出率。[结论]CPA检测是一种实用、有效的BVDV诊断工具。

交叉等温扩增技术快速检测幽门螺杆菌方法的建立

目的建立一种新型的交叉引物等温扩增技术(cross-primer amplification,CPA)检测组织中的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.Pylori),为临床诊断幽门螺杆菌感染提供快速、灵敏、有效的检测方法。方法针对幽门螺杆菌尿霉素B基因(UreB)为靶序列设计3套交叉引物等温扩增方法的特异性引物,随后对反应体系的扩增温度、Bst DNA聚合酶浓度和扩增时间进行优化;选取2株幽门螺杆菌与其他7株致病菌进行特异性和敏感性试验;以尿素呼气法(UBT)为参考标准,检验CPA法对75例临床胃黏膜组织样本中幽门螺旋菌的检测灵敏度。结果幽门螺杆菌反应最佳引物组合为HCPA-3,最优反应温度为62℃、Bst DNA聚合酶浓度为6 U、反应时间为60 min;建立的方法具有较好的特异性,且检测灵敏度为1.26×102 cfu/mL;75例临床胃黏膜组织样本进行检测结果显示,CPA方法共检测出阳性标本26例,检出率为34.57%,准确率为96.30%(26/27)。结论 CPA法是一种快速、简便且高灵敏性和特异性的诊断方法,为临床上快速诊断幽门螺杆菌奠定了基础。

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10^1cfu/mL,当每25g样品中有10^0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。

等温扩增技术在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用

评价交叉引物恒温扩增方法对食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的检测效果。应用针对凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌建立等温扩增方法对5类15种食品进行凝固酶阳性金黄色葡萄球菌检测,根据ISO 5725-2:1994标准要求,以现行国家标准为基准方法,对交叉引物-待确认方法进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等五方面验证。建立的交叉引物等温扩增方法灵敏度100%、特异性98.1%、假阴性率0、假阳性率1.9%、相对准确度98.3%。

交叉引物恒温扩增技术在副溶血性弧菌毒力基因检测中的应用

目的 建立一种快速检测副溶血性弧菌耐热直接溶血素（TDH）和不耐热溶血素（TLH）的CPA-核酸试纸条法.方法 根据副溶血性弧菌的TDH和TLH毒力基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应体系进行优化,确立最佳反应温度和时间,并将CPA方法与荧光定量PCR法进行比较与评价.结果 本研究建立的CPA-核酸试纸条法最佳反应温度和时间为60℃40 min,对副溶血性弧菌的TDH和TLH毒力基因检测具有高度特异性,对副溶血性弧菌的TLH和TDH检出极限分别为1.8 cfu/ml和16.0 cfu/m,与荧光定量PCR法一致;而且具有较好的稳定性.464株菌株中检出副溶血性弧菌TLH和TDH基因阳性率分别为100％（464/464）和72.6％（337/464）,其中,水产品中分离株TDH毒力基因阳性率为7.81％ （10/128）;临床标本分离株TDH毒力基因阳性率为97.32％ （327/336）.结论 该方法检测副溶血性弧菌TLH和TDH基因,具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强以及操作简便等特点,可用于副溶血性弧菌的现场快速检测.

交叉引物恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因

目的建立一种特异、灵敏、简便的交叉引物恒温扩增(cross priming amplification,CPA)技术,快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)耐热直接溶血素基因(tdh)。方法根据Gen Bank上公布的VP tdh基因序列,在其保守区域设计CPA引物和探针,并对反应体系和反应条件进行优化,同时验证方法的灵敏度和特异性。结果本方法对tdh基因检测具有高度特异性;对tdh阳性质粒DNA和菌液检测的灵敏度分别达到了1.8×101copy/μl和6.2×103cfu/ml;对82份临床标本的检测阳性率与荧光PCR法相同,大大高于传统培养法。结论本研究建立的CPA法快速、简便、灵敏、特异,适用于VP腹泻患者的床边诊断以及食物中毒的现场快速检验中。