交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备及其性质

交联酶聚集体法是一种新型的无载体酶固定化方法。本实验用该法固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶,对其制备条件、结构特征、酶学性质进行了研究。结果表明,β-葡萄糖苷酶酶液在冰水浴中经90%的硫酸铵沉淀30min后,以5%戊二醛水溶液进行酶聚集体交联反应,可获得较高活性的交联酶聚集体,酶活回收率达75%,对对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作用的最适温度、最适pH值和Km值分别为60℃、pH4.0和4.61×10-3mol/L,与游离酶相比,表现更高的底物亲和力。将其用于大豆异黄酮活性苷元染料木素的合成,40min内对染料木苷转化率达到66%。

交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备及应用

交联酶聚集体(CLEAs)是一种新型的无载体固定化方法。本研究利用该法对来源于西梅籽的β-葡萄糖苷酶进行了固定化研究。优化了制备交联β-葡萄糖苷酶聚集体的条件,并探讨其在丙基β-D-葡萄糖苷合成中的应用。研究发现,最适的沉降剂及其比例、最适交联剂(戊二醛)浓度以及交联时间分别为正丙醇、2/1(V/V)、10 mmol/L和2 h。在最适条件下,正丙醇-CLEAs的活力回收达84%。该固定化酶催化丙基β-D-葡萄糖苷合成反应96 h后,收率为60%。

特殊反应体系中交联β-葡萄糖苷酶聚集体催化合成红景天苷

采用具有较高操作稳定性的交联β-葡萄糖苷酶聚集体,在离子液体-混合有机溶剂-缓冲溶液的非常规反应体系中酶催化直接糖基化合成红景天苷,筛选反应体系的组成和各成分的比例.结果表明,反应体系的组成为(%,φ):1,4-二氧六环42.5,离子液体C4MIm·PF6 8.5,乙酸乙酯34,p H 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液15.0.该体系在水含量高达15%(φ)的条件下水活度为0.66,适合直接糖基化反应.底物β-D-葡萄糖100 g/L、对羟基苯乙醇200 g/L时,在50℃及250 r/min下反应120 h达到平衡,红景天苷最大浓度可达25.32 g/L.

疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的基因组挖掘与表达

基因组挖掘是发现生物催化剂的高效工具,开发热稳定性β-葡萄糖苷酶具有重要的应用价值.该文采用基因组挖掘策略,从嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌的基因组中挖掘出7个注释为β-葡萄糖苷酶基因或β-葡萄糖苷酶预测蛋白基因,其中TLG-1、TLG-2、TLG-4、TLG-5、TLG-6属于GH3家族,TLG-3和TLG-7分别属于GH1家族和GH17家族,且TLG-7与GenBank数据库已有序列的同源性很低,只有48.43%.选择同源性低的、同源序列被研究少的TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7进行基因克隆和毕赤酵母异源表达,重组毕赤酵母经甲醇诱导表达后,用发酵液上清进行SDS-PAGE分析,结果表明TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7均成功分泌表达.对发酵液进行β-葡萄糖苷酶活力测定结果表明:TLG-2的活力最高,达到166.6 U·mL^(-1);其次是TLG-5的活力,其值为79.8 U·mL^(-1),TLG-6和TLG-7的活力较低,分别为9.9 U·mL^(-1)和9.5 U·mL^(-1).研究结果为疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的应用奠定了基础.

青钱柳叶化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的 研究青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinskaja叶的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法 青钱柳叶95%乙醇提取物采用大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、聚酰胺、C18反相硅胶及半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用PNPG法评价其α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果 从中分离得到15个化合物,分别鉴定为cyclopaloside C(1)、cyclopaloside A(2)、juglanosides E(3)、vaccinin A(4)、ent-mururin A(5)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(6)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯(8)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸乙酯(9)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸丁酯(10)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(11)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(12)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(13)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸丁酯(14)、香橙素(15)。总提取物抑制α-葡萄糖苷酶的IC_(50)值为(1.83±0.04)μg/mL,化合物1、4~5分别为(29.48±1.86)、(0.50±0.07)、(0.71±0.07)μmol/L。结论 化合物1为新四氢萘醇苷类,化合物4~5、8~10、14为首次从青钱柳叶中分离得到。化合物4~5为较少见的黄酮木脂素类化合物,对α-葡萄糖苷酶具有潜在的抑制活性。

红小豆提取物对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用

采用体积分数70%乙醇对红小豆进行提取,提取物经水混旋,然后依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂萃取。正丁醇萃取相浓缩干燥后经AB-8大孔树脂吸附,以不同体积分数乙醇洗脱,测定洗脱相浓缩液中总三萜皂苷和总黄酮的含量,并探究洗脱相浓缩液对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用。结果显示:体积分数70%和95%乙醇洗脱组分中的总三萜皂苷含量高于其他组分,且体积分数70%乙醇洗脱组分的总黄酮含量最高,为(181.83±3.09)mg/g;体积分数95%、70%、50%乙醇洗脱组分对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶均具有较好的抑制活性;体积分数95%乙醇洗脱组分对2种酶的抑制类型均为混合型抑制。

智能手机辅助双探针比色法检测α-葡萄糖苷酶

该文以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和罗丹明B为比色探针,建立了α-葡萄糖苷酶的比色检测方法,并在此基础上基于智能手机策略,通过RGB值对α-葡萄糖苷酶进行检测。结果表明,Fe^(3+)-TMB-罗丹明B显色体系的吸光度与α-葡萄糖苷浓度在20~100 U/L范围内呈线性关系,检出限为3.3 U/L。采用photo⁃shop软件分析样品图像和样品荧光图像的RGB值,其与α-葡萄糖苷酶浓度在10~100 U/L范围内呈线性关系,检出限分别为2.5 U/L和1.2 U/L。该法已成功用于α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖抑制率评估和胎牛血清中α-葡萄糖苷酶浓度的测定。所构建的智能手机辅助检测法为α-葡萄糖苷酶的临床分析和酶抑制剂的快速筛选提供了简便、快捷和准确的方法。

昆布多糖的复合酶法提取工艺优化及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

优化复合酶提取昆布多糖的工艺参数,并考察其抑制α-葡萄糖苷酶的能力。以昆布多糖得率为评价指标,通过正交试验确定复合酶配比,采用响应面法评价酶解时间、pH、液料比和温度对昆布多糖得率的影响。采用体外酶抑制实验测定昆布多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明,复合酶最佳添加量为纤维素酶100 mg、果胶酶90 mg、木瓜蛋白酶55 mg,最佳酶法提取工艺为酶解时间1.8 h、酶解温度49.4℃、pH6.1、液料比59:1 mL/g,最佳工艺条件下昆布多糖预测得率18.183%,实测多糖得率18.19%±1.04%,其中性糖、酸性糖、蛋白质及硫酸根含量分别52.72%、11.76%、2.66%、19.49%;在1~5 mg/mL范围内其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随浓度增加而升高,最大抑制率为79.04%±3.17%,IC50为1.443 mg/mL。复合酶法提取的昆布多糖得率高,其对α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用。

青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以青香蕉为原料提取多酚,利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术对多酚提取物进行成分鉴定,并通过体外实验评价香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,探究青香蕉降血糖的部分机制。结果表明:青香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出28种化合物,包括21种多酚类化合物、2种有机酸、3种鞣花单宁代谢产物、以及香兰素和香豆素,检测到香蕉果肉中含有秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3种多酚类化合物,此外,二甲基鞣花酸和尿石素A为主要色谱峰;体外实验结果显示,香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均存在抑制作用,质量浓度为1.0 mg/mL时,对α-淀粉酶抑制率为(76.25±3.79)%,半抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.53 mg/mL;质量浓度为160μg/mL时,对α-葡萄糖苷酶抑制率为(92.54±0.69)%,IC50为35.76μg/mL。因此,多酚可能是青香蕉能够降血糖的活性成分之一。

甜茶的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

为探究甜茶(Rubus suavissimus)中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的次级代谢产物,该文利用多种现代色谱分离技术对其干燥叶进行提取分离纯化,综合运用质谱、核磁共振波谱分析方法确定了单体化合物的结构,并对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。结果表明:(1)从甜茶的干燥叶中分离鉴定出10个化合物,分别为甜茶苷(1)、山奈酚-3-O-洋槐糖苷(2)、没食子酸(3)、二聚松柏醇(4)、5-甲氧基二聚松柏醇(5)、云实酸(6)、斯替维单糖苷(7)、斯替维醇(8)、16α,17-二羟基对映贝壳杉烷(9)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(10),其中化合物2、4、5、9均为首次从甜茶中分离得到。(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果显示,化合物2、3、5、6、10具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。该研究结果丰富了甜茶中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,并为降血糖相关产品的开发提供了理论依据。

乌拉尔甘草不同组织可培养内生菌分离筛选及产β-葡萄糖苷酶菌株初筛

【目的】研究新疆阿勒泰地区乌拉尔甘草不同组织可培养内生菌的资源状况以及选育高产β-葡萄糖苷酶菌株。【方法】以乌拉尔甘草为材料,运用组织匀浆法与16S rDNA和ITS-rDNA分子生物学方法相结合方式,对其主根、须根、茎、叶中的内生菌进行分离、纯化和鉴定;采用七叶苷培养基和β-葡萄糖苷酶酶活力测定筛选产β-葡萄糖苷酶菌株。【结果】从甘草中分离获得内生菌共48株,其中内生细菌33株,内生真菌15株。在主根和茎部位分离内生细菌数量最多,内生真菌在主根中定殖的数量最多。33株甘草内生细菌隶属于8个属,芽孢杆菌属菌株分离获得最多,且甘草主根部位的内生细菌分离种类最多,在甘草不同组织中多样性表现为主根>须根=茎=叶。15株甘草内生真菌隶属于7个属,枝孢属是甘草内生真菌的优势属,内生真菌在不同组织中多样性表现为主根>茎>叶>须根。共有12株具有产β-葡萄糖苷酶的能力,其中分离自主根部位的菌株最多,占比41.7%。【结论】甘草主根组织的可培养内生菌的多样性相较其他组织丰富,且主根部位产β-葡萄糖苷酶菌株较多,是选育产酶菌株的优势部位。

元江锥叶化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的研究元江锥叶化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法元江锥叶甲醇提取物采用MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20、Diaion HP20SS等多种柱色谱进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用PNPG法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果从中分离得到18个化合物,分别鉴定为原儿茶酸(1)、没食子酸(2)、3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖基-4-羟基苯甲酸(3)、3-O-没食子酰基莽草酸(4)、methyl 4-epi-shikimate-3-O-gallate(5)、5-O-没食子酰基莽草酸(6)、5-O-咖啡酰基莽草酸(7)、6-O-没食子酰基-葡萄糖苷(8)、1,6-二-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、1,3-二-O-没食子酰基-α-D-葡萄糖苷(10)、2,3-二-O-没食子酰基-D-葡萄糖苷(11)、β-O-methylgluco-2,3-digalloyl esters(12)、(3 R,1′S)-[1′-(6″-O-galloyl-β-D-gluco-pyranosyl)oxyethyl]-3-hydroxy-dihydrofuran-2(3H)-one(13)、4-O-D-(6′-O-galloyl)glucopyranyl-(E)-p-coumaryl acid(14)、chestanin(15)、1-desgalloyl eugeniin(16)、picrorhiza acid(17)、11-诃子裂酸甲酯(18)。化合物2和16的IC_(50)值分别为(0.12±0.059)、(0.00089±0.00025)mmol/L。结论所有化合物均为首次从元江锥叶中分离得到。化合物2和16具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

玉竹地上部位化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的:研究玉竹地上部位的化学成分及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法:采用大孔吸附树脂HP-20、Sephadex LH-20、MCI gel CHP 20P、Chromatorex C18、半制备型高效液相等色谱法对玉竹地上部位75%甲醇提取物进行分离纯化,通过1H-NMR、13C-NMR等波谱技术对化合物进行结构鉴定,并采用α-葡萄糖苷酶活性筛选模型对部分化合物进行活性筛选。结果:从玉竹地上部位中分离得到16个化合物,分别鉴定为:对羟基苯甲酸(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖苷(2)、异金雀花素(3)、异槲皮苷(4)、肥皂草苷(5)、山柰酚-3-O-β-芸香苷(6)、芦丁(7)、异鼠李素-3-O-芸香苷(8)、牡荆素-2″-O-葡萄糖苷(9)、牡荆素-4″-O-葡萄糖苷(10)、牡荆素-2″-O-β-D-(6‴-乙酰基)-葡萄糖苷(11)、异牡荆素-2″-O-β-D-葡萄糖苷(12)、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-葡萄糖苷(13)、槲皮素-7-O-[α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷](14)、金圣草黄素-7-O-槐糖苷(15)、金圣草黄素-7-O-[β-D-芹菜糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖苷(16),并筛选了部分化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。结论:其中,化合物2~6、10~16为首次从该植物中分离得到。化合物2具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

窄孢灵芝化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的研究窄孢灵芝Ganoderma angustisporum J.H.Xing,B.K.Cui&Y.C.Dai的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法窄孢灵芝乙酸乙酯提取物采用硅胶、ODS、TLC、HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用pNPG法评价其α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果从中分离得到7个化合物,分别鉴定为N-acetyl-L-phenylalanine ethyl ester(1)、N-acetyl-L-phenylalanine methyl ester(2)、4-hydroxy-17R-methylincisterol(3)、6,8-di-O-methylaverufin(4)、aversin(5)、methyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、5-甲苯-1,3-二醇(7)。化合物1~2、4~7的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC_(50)值分别为(33.80±0.47)、(45.45±7.95)、(48.80±5.86)、(39.48±2.82)、(41.47±6.68)、(55.38±10.12)μmol/L,其中化合物1的抑制活性较强。结论化合物1为新天然产物,化合物2~7为首次从灵芝属中分离得到。化合物1~2、4~7具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。

黄芪多糖复合酶提取工艺优化及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

目的:以黄芪为原料,采用复合酶法(木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶)提取黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS),并分析工艺条件对多糖提取的影响。方法:在正交试验确定复合酶比例的基础上,采用响应面法对复合酶提取APS的提取条件进行优化,得到最优工艺条件,采用pNPG法评价其α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果:5 g黄芪药材粉末,最佳复合酶配比为:木瓜蛋白酶88000 U、果胶酶65000 U、纤维素酶6000 U;最佳酶解提取条件为:酶解处理时间、温度、pH和料液比分别为2.82 h、60.34℃、5.11和1:34.46 g/mL,APS的得率最高可达22.79%±0.14%;APS对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为7.42μg/mL。结论:复合酶提取APS的得率较单酶得率显著提高,APS对α-葡萄糖苷酶表现出较强的抑制作用。

基于α-葡萄糖苷酶抑制活性评价青稞全粉提取物抑制效果及其相互作用

青稞是我国青藏高原地区特有的粮食作物,具有良好的改善血糖代谢功效,但其具体降糖活性成分以及它们之间的配伍关系尚未明确。以青稞全粉为研究对象,提取青稞全粉中的多酚、多糖、多肽三种关键活性成分,探究青稞全粉提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力及其相互作用。通过单因素实验以及Box-Benhnken响应面优化实验,确定了利用微孔板法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性的最佳反应体系,即酶浓度0.5 U/mL、缓冲液浓度80 mmol/L、底物浓度5 mmol/L。三种青稞全粉提取物均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中青稞多酚的抑制活性最强,α-葡萄糖苷酶活性抑制率达到83.63%±2.92%,对应的IC_(50)值为0.18 mg/mL。三种青稞全粉提取物两两复配均具有一定的协同增效作用。结果可为血糖控制人群的膳食选择和功能性食品的复配开发提供理论指导。

低共熔溶剂提取酸枣果肉多糖工艺及其对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的:为提高酸枣果肉的利用率,利用低共熔溶剂(DES)提取酸枣果肉多糖(WJFP)并优化其提取工艺,探究WJFP对α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法:采用单因素和响应面实验以多糖得率为指标筛选最佳提取工艺,利用HPAEC分析其单糖组成并测定WJFP对α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果:最佳DES体系为氯化胆碱-尿素(CCU),摩尔比为1∶2;最佳提取工艺为超声时间62 min、超声温度54℃、含水量24%、料液比1∶20(g·mL^(-1)),在此条件下,WJFP得率可达5.57%;单糖组成分析得阿拉伯糖和半乳糖醛酸为WJFP主要单糖;0.2 mg·mL^(-1)WJFP对α-葡萄糖苷酶的抑制活性可达到82.05%。结论:利用DES提取所得WJFP对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性,拓宽了酸枣果肉的开发前景。

酶法制备花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺优化

为促进花生蛋白资源的开发利用及发挥花生肽的降血糖作用,采用碱溶酸沉法制备花生蛋白,并利用不同商品蛋白酶水解花生蛋白制备花生肽。以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标,对蛋白酶进行了筛选。在此基础上,采用单因素试验和响应面试验对花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺进行了优化。另外,考察了花生蛋白水解度和花生肽α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性。结果表明:与其他商品蛋白酶相比,胰蛋白酶制备的花生肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高;酶法制备花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的最优工艺条件为将花生蛋白于95℃加热5 min进行预处理,采用胰蛋白酶水解,水解时间62 min,加酶量8.9%,底物质量浓度4.1 g/100 mL,在最优条件下花生肽α-葡萄糖苷酶抑制率达到(68.82±0.24)%,此时花生蛋白的水解度为10.09%;水解度在8.0%~11.5%范围内与花生肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈显著正相关。综上,花生蛋白经胰蛋白酶水解后得到的花生肽对α-葡萄糖苷酶具有显著的体外抑制活性。

芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机理

抑制α-葡萄糖苷酶活性是控制机体血糖平衡的有效途径。该文通过酶活性实验、紫外光谱法、荧光光谱法、傅里叶变换红外光谱和分子对接等方法研究了芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机理。结果表明,AE对α-葡萄糖苷酶活性有显著抑制作用[IC_(50)=(0.031±0.001)mg/mL],抑制类型为混合型抑制。AE通过一个结合位点与酶结合,使酶中的荧光基团发生静态猝灭。AE改变了酶的构象,使酶的α-螺旋、β-转角含量降低,β-折叠、无规则卷曲含量增加。分子对接深入分析结果显示,AE与Thr290、Leu297、Glu296和Asn2592形成氢键,与Leu297等形成范德华力。AE通过这些分子间作用力结合到α-葡萄糖苷酶的疏水结合腔内,改变了酶的构象,使酶活性降低。

芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制机理及其与阿卡波糖的协同作用

为探讨芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的相互作用,本实验采用酶抑制动力学、紫外光谱、红外光谱、荧光光谱等多种光谱分析法研究芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制机理,并研究芦荟大黄素与阿卡波糖联用的协同效应。结果显示,相较于阿卡波糖,芦荟大黄素具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制效果,属于非竞争性和反竞争性的混合型抑制剂。紫外光谱结果表明芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶之间通过相互作用形成了新的复合物。红外光谱中酰胺基团的特征振动结果表明随着芦荟大黄素加入,α-葡萄糖苷酶结构构象发生变化。荧光猝灭实验结果说明,芦荟大黄素是以静态猝灭的方式猝灭α-葡萄糖苷酶的内源性荧光。此外,芦荟大黄素和阿卡波糖联用对α-葡萄糖苷酶活性有一定的协同抑制效果。本研究揭示了芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制,为未来将芦荟大黄素作为调节人体血糖的保健食品配方提供了实验依据。