β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。

乳糖酶交联酶聚体的制备及性能

以双醛淀粉(DAS)为交联剂,分别制备了乳酸克鲁维酵母和米曲霉来源的乳糖酶交联酶聚体(CLEAs),同时添加牛血清白蛋白(BSA)作为保护剂以提高CLEAs活性。当DAS质量分数为10%、氧化度为80%、BSA与酶蛋白质量比为1∶8时得到的酵母和曲霉乳糖酶CLEAs的活力保留分别为53.84%和55.25%。CLEAs的最适pH值较游离酶有所降低。曲霉乳糖酶CLEAs在60℃下具有较好的热稳定性,并且在37℃下重复使用5次(20 h)后活力可保留52%。

以大孔硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备及性质研究

通过交联酶聚体与氨基化硅胶(活化硅胶)的共价交联,制备了以氨基化硅胶、无氨基化硅胶为载体的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体MSG(SG)-PAL-CLEAs、SG-PAL-CLEAs。优化了硅胶的氨基化条件以及MSG-PAL-CLEAs的制备条件,并且对游离酶,苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(PAL-CLEAs),MSG-PAL-CLEAs和SG-PAL-CLEAs的稳定性进行了比较。优化的硅胶氨基化条件:3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)/硅胶2∶1(v/w),氨基化温度110℃,氨基化时间10h,在此条件下所得硅胶键合氨基数目是480μmol/g硅胶。优化的MSG-PAL-CLEAs制备条件:0.05g硅胶/mL酶液,吸附时间2.5h,吸附pH8.8,沉淀剂为硫酸铵,饱和度80%,交联剂戊二醛的浓度为1%,交联时间1h。SG-PALCLEAs的制备条件和MSG-PAL-CLEAs的制备条件大体相似,不同的是沉淀剂硫酸铵的饱和度为40%,交联剂戊二醛的终浓度为1.5%。研究结果表明,制备得到的MSG-PAL-CLEAs和SG-PAL-CLEAs的酶活回收率均为45%左右。与传统的PAL-CLEAs相比,MSG-PAL-CLEAs的重复使用性和储藏稳定性均有了显著提高,MSG-PAL-CLEAs转化4个批次后,酶活保留79%,而PAL-CLEAs转化2个批次酶活仅保留49%。25℃,PAL-CLEAs储存29d酶活保留26%,而MSG-PAL-CLEAs的酶活保留仍高达50%。

交联酶聚体制备的研究进展

交联酶聚体是一种无需载体、无需酶的纯化、制备简单、成本低和高稳定性的新型固定化酶方法,具有广阔的应用前景。对交联酶聚体制备过程中影响酶活性的相关因素等最新研究进展进行了总结与分析。并对其应用及发展进行了展望,旨在为进一步的研究提供基础。

乳糖酶交联酶聚体口服制剂的研究

乳糖酶具有良好的抗胰酶水解性能,适于作为口服制剂治疗乳糖不耐受症,但其抗胃酸能力较差,以海藻酸(ALG)为载体,并附尤特奇膜,制备乳糖酶交联酶聚体(CLEAs)口服制剂,其最佳制备条件为:以质量分数3%ALG与CLEAs混合液在质量分数3%CaCl2溶液中凝胶30 min得到凝胶微球,并覆3层质量分数3%尤特奇包衣,经胃肠液降解释放后活力保留可达43.29%,并且在肠液中1 h后释放出最大酶活。

苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体的制备及部分催化性能研究

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酶法生产L-苯丙氨酸的关键酶,目前主要利用红酵母PAL进行转化,但红酵母PAL稳定性较差,妨碍了其工业化的应用。该研究将交联酶聚体和印迹酶的制备方法相结合,制备出新型固定化酶-苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体,筛选出最优的底物印迹分子,并考察了该固定化酶的部分特性。结果表明,反式肉桂酸是制备印迹PAL交联酶聚体的最适底物,所制备印迹交联酶聚体的最适催化温度和pH值分别是50℃和10.5,并表现出较好的重复使用性,连续催化9个批次后,仍保持了32%的酶活保留率。

以粗孔微球硅胶为核芯的交联酶聚体的制备

采用苯丙氨酸解氨酶(PAL)为模型酶,制备了以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(NH-PAL-CLEAs),优化了制备条件。并研究了NH-PAL-CLEAs的部分催化性能。研究结果表明,当硅胶量为117.75mg,酶液添加量为1mL(2U),戊二醛浓度为0.2%(体积分数)时,所制备的NH-PAL-CLEAs的最大酶活回收率是25%。与传统的PAL-CLEAs相比,NHPAL-CLEAS无需离心或过滤,只用短时间静置就能被回收重复利用。同时,NH-PAL-CLEAs也表现出较好的操作稳定性。这种制备方法不仅克服传统制备交联酶聚体(CLEAs)颗粒小、难回收,离心或过滤回收易结块的问题,而且缩短了生产周期,减少了能源消耗,提高了固定化酶的利用率,是一种非常具有工业应用前景的固定化酶方法。

牛血清白蛋白对牛胰脂肪酶交联酶聚体制备及催化性能的影响

研究了牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)对牛胰脂肪酶交联酶聚体(Lipase-CLEAs)制备及其催化性能的影响。获得的优化制备条件为:BSA的添加质量浓度为0.05 g/L,用1%戊二醛交联2 h。在此条件下制备的固定化酶最大酶活回收率为70%,比不添加BSA制备的Lipase-CLEAs提高了15%。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度被提高了10℃,同时,添加BSA制备的Lipase-CLEAs的温度稳定性、p H和储存稳定性比游离酶和Lipase-CLEAs都有较大提高。在重复使用8次后,添加BSA制备的Lipase-CLEAs仍能保持初始酶活的80%,但未添加BSA制备的CLEAs只保留了30%的初始酶活。

青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学

以0.53 g/mL硫酸铵为沉淀剂,0.35%(体积分数)戊二醛为交联剂制得青霉素酰化酶交联酶聚体(CLEAs),酶活收率30.1%,其最适温度(57℃)比游离酶提高10℃,最适pH(10.0)向碱性偏移1.7个单位.对比游离酶及其CLEAs的热稳定性和热失活动力学模型发现,游离青霉素酰化酶制成CLEAs后,其热失活动力学模型由一步失活转变为连串失活,失活反应活化能由248.8 kJ/mol增加至549.2 kJ/mol,对CLEAs热稳定性大幅提高的原因进行了解释.CLEAs重复利用7次后,酶活保留56%以上,具有良好的重复利用性.

牛血清白蛋白辅助交联对苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体影响的研究

通过牛血清白蛋白(BSA)辅助交联,制备了牛血清白蛋白苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(BSA-PAL-CLEAs)。优化了BSA-PAL-CLEAs的制备条件,并比较研究了游离酶、苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(PAL-CLEAs)和BSA-PAL-CLEAs的稳定性差异。研究发现,BSA-PAL-CLEAs的最佳制备条件:BSA浓度为5mg/mL,硫酸铵饱和度80%,戊二醛(10%v/v)10μL,交联时间2h,所得BSA-PAL-CLEAs的酶活回收率(25%)是不加BSA时(13%)的1.92倍。稳定性研究表明,BSA-PAL-CLEAs的温度稳定性、储藏稳定性比PAL-CLEAs都有所提高;但是,游离酶、PAL-CLEAs、BSA-PAL-CLEAs的pH稳定性相差不大;BSA-PAL-CLEAs在有机溶剂中的稳定性比PAL-CLEAs有所下降。

MJL交联酶聚体的制备及性质研究

本实验制备MJL交联酶聚体并对其性质进行研究。运用交联酶聚体技术制备MJL交联酶聚体;测定游离MJL和CLEAs的酶活,最适pH和温度;比较MJL交联酶和游离酶在室温下的稳定性。方法:利用戊二醛做交联剂制备MJL交联酶聚体;α-乙酸萘酯法测定游离MJL及MJL交联酶聚体的最适pH和温度。实验结果显示,交联后酶适应温度范围变宽,最适pH较游离酶(pH7.0)向酸性偏移。结论:交联后脂肪酶聚活性变化较低,对温度、pH的耐受性提高,稳定性也有所提高。

木瓜蛋白酶交联聚体的制备及性质

采用交联酶聚体(CLEAs)技术制得了木瓜蛋白酶CLEAs,优化了制备条件.以纯乙醇为蛋白沉淀剂,质量分数40%戊二醛为交联剂,于4℃下对酶沉淀聚体交联16h;所得木瓜蛋白酶CLEAs的最适pH为6.0(游离酶最适pH=7.0),最适温度范围由游离酶的80℃拓宽为50～80℃,热稳定性和溶液稳定性亦明显提高;微观形貌分析证明木瓜蛋白酶CLEAs优良的催化效能及稳定性来自于CLEAs单元所具有的高比表面积及单元内部多点共价固定的结合方式.

交联酶聚体技术研究进展

交联酶聚体(CLEAs)是一类新型的固定化酶技术,具有制备简单、酶活回收率高、操作和保存稳定性强等优点。近年来,CLEAs技术与材料学、印迹工程、介质工程、反应工程学等相结合取得了一系列新进展,包括载体固定化CLEAs、包埋CLEAs、印迹法CLEAs、多酶CLEAs、CLEAs膜浆反应器等,在手性分子拆分与合成、抗生素生产等领域取得了一些成果。本文对CLEAs酶活影响因素及CLEAs技术的最新研究进展进行了分析与总结,并展望了需进一步深入开展的内容,有助于生物工程、酶工程、化学工程和材料科学等领域相关研究工作的开展。

胰蛋白酶交联聚体的制备及性质研究

交联酶聚体(CLEA)是一种新型的无载体固定化技术.以胰蛋白酶为模型体系,系统地研究了CLEA技术的制备工艺、应用条件、稳定性及结构形貌.(1)在制备工艺中考察了各步骤对CLEA酶活保留的影响,重点分析了沉淀剂浓度、类型的影响,结果表明100%乙醇是较为理想的沉淀剂;(2)在应用条件确定中测定CLEA的最适催化温度为70℃,最适催化pH为9.0,并解释了温度-活性、pH-活性曲线的漂移现象;(3)稳定性研究结果表明CLEA技术大幅提高了胰蛋白酶的热稳定性、溶剂稳定性,且无酶泄漏;(4)在形貌表征中分别利用扫描电子显微镜、光学显微镜和激光粒度分析对CLEA的微观结构进行了多尺度研究,着重讨论了其独特结构与优良特性间的关系.本文所得结论为胰蛋白酶CLEA的应用提供基础数据,并为CLEA技术应用于其它酶种提供参考。

β-半乳糖苷酶磁性交联酶聚体的制备及性质研究

制备了β-半乳糖苷酶磁性交联酶聚体,优化了制备条件,并对其酶学性质进行了系统研究.实验结果表明,最优的制备条件为,4.2 mg Fe3O4磁性纳米颗粒,20 mg/m L的BSA 2m L,吸附时间为1.5 h,β-半乳糖苷酶酶液50μL,沉淀剂为异丙醇,体积比为1∶1,沉淀时间1h,戊二醛体积分数为0.125%,交联时间1 h,在此条件下得到的β-半乳糖苷酶M-CLEAs酶活保留率为58.67%.扫描电镜观察显示β-半乳糖苷酶磁性交联酶聚体呈多孔结构,比表面积大.与游离酶相比,β-半乳糖苷酶M-CLEAs具有更加宽泛的催化温度和p H范围,同时表现出较好的重复利用性.

交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用

基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术,从白色念珠菌Candida albicans基因组中克隆了一条新型醇脱氢酶(CADH)基因,并在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中表达。为克服游离酶稳定性差、不能重复使用的缺点,探索并优化了交联醇脱氢酶聚集体(CLEAs-CA)的制备条件。结果表明:重组CADH对底物四氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的比活力为1.8 U/mg,产物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)的对映体过量值大于99%。CLEAsCA沉淀剂选择为60%饱和度的(NH_4)_2SO_4,交联剂为10 mmol/L戊二醛。在固定化操作前,加入50 mmol/L异丙醇和0.1 mmol/L NAD^+对CADH催化活性位点、辅酶结合位点进行保护,CLEAs-CA的活力回收率提高了48.3%。将CLEAs-CA用于不对称合成(R)-CHBE,经过19次的重复使用,CLEAs-CA的活性仍保留有50%。

牛胰脂肪酶交连酶聚体的制备及性能研究

以牛胰脂肪酶(cattle pancreatic lipase,CPL)为研究对象,采用交联酶聚体技术,研究交联酶聚体脂肪酶(CPL-CLEAs)的制备条件、催化性能和酶促反应动力学参数。结果表明,交联酶聚体脂肪酶制备的最优制备条件为:硫酸铵饱和度80%,戊二醛终浓度1.5%,交联时间1 h,在此条件下,所得CPL-CLEAs最高酶活回收率为90%。CPL-CLEAs的最适催化温度是60℃,与游离脂肪酶相比,CPL-CLEAs的最适催化温度提高了10℃,且温度稳定性、储存稳定性和操作稳定性均有所提高。重复使用7次后,CPL-CLEAs仍能保持初始酶活的43%。

木瓜蛋白酶无载体固定化研究

交联酶聚体(CLEA)是一种新型的无载体固定化技术。以木瓜蛋白酶为模型体系,系统地研究了木瓜蛋白酶的提取纯化方法,固定化制备CLEA的方法以及游离木瓜蛋白酶和CLEA的应用条件、稳定性和不同离子对其活力的影响。结果表明,最适催化温度游离酶为65℃,CLEA最适催化温度为75℃;游离酶最适催化pH值为6.6,CLEA最适催化pH值为7.6;米氏常数Km游离酶为1.25μmol/mL,CLEA为0.44μmol/mL。与游离木瓜蛋白酶相比,CLEA的米氏常数Km减小,具有耐高温、活性强、稳定性好等特征,能耐受一定pH值和温度变化,对金属离子不敏感。

多孔化CLEAs催化降解壳聚糖制备活性低聚糖

针对传统交联酶聚体(CLEAs)催化大分子底物传质限制严重的问题,作者利用多孔化CLEAs(p-CLEAs)实现了壳聚糖酶法降解制备生物活性低聚糖。相同条件下p-CLEAs催化所生成还原糖量是游离酶的85%,是传统CLEAs的4倍。p-CLEAs所具有的多孔化结构造成了反应物相对分子质量和多分散性指数具有与游离酶催化不同的变化规律。通过控制酶解时间,结合超滤膜分离得到了相对分子质量为5 000~10 000的低聚糖产品,占总酶解产物质量的67.5%。抑菌性实验发现,当低聚壳聚糖(5 000~10 000)质量浓度为0.275 mg/m L时,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌达到完全抑制。