一种基于儿茶素的多酚氧化酶交联聚集体制备及其高效催化合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯研究

为了更加高效低成本地制备茶黄素,以儿茶素作为多酚氧化酶蛋白的交联试剂,对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的多酚氧化酶进行了酶交联聚集体的制备并应用于茶黄素-3,3’-双没食子酸酯的合成。通过对酶交联参数优化以及交联前后的酶催化性能研究,结果表明,在pH 4.0,EGCG为0.5 mg·mL^(-1),多酚氧化酶活性200 U·mL^(-1),交联时间50 min时,可以获得交联酶的最佳酶活回收率。与游离酶相比,交联酶表现出更优异的催化性能(热稳定性、有机溶剂耐受性、底物耐受性)。交联酶被用于合成茶黄素-3,3’-双没食子酸酯时,产物质量浓度可达800μg·mL^(-1),且交联酶能被重复循环使用至少3个批次,利用该方法制备茶黄素,可以显著降低酶的应用成本,具有潜在工业化应用价值。

交联海藻糖合酶聚集体的制备及其性质

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术制备交联海藻糖合酶聚集体,研究不同沉淀剂、酶与交联剂浓度比例、交联强度及硼氢化钠还原处理对海藻糖合酶CLEAs活性的影响及其结构特征与反应性能。结果表明:采用质量浓度为10mg/mL的酶以质量浓度为30mg/mL的聚乙二醇(PEG)为沉淀剂,以体积分数为0.5%的戊二醛室温交联2h,再以硼氢化钠还原处理后,制备得到的海藻糖合酶CLEAs最适催化温度为70℃,比游离酶提高20℃,最适pH值为7.0,与游离酶相比,CLEAs的温度及pH值稳定性均得到提高,对Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金属离子的抗性明显增强。微观形貌分析表明单个海藻糖合酶聚集体粒径在0.2～0.5μm,众多聚集体以"脚手架"结构形成大小不一的集簇。

交联果胶酶聚集体的制备及其对罗布麻的脱胶效果

运用交联酶聚集体技术对枯草芽孢杆菌FM208849所产的果胶酶进行固定化,将制得的交联果胶酶聚集体用于罗布麻皮脱胶。结果表明,以体积分数为4%的戊二醛溶液在30℃水浴中对果胶酶聚集体交联135min,可以得到性能优异的交联果胶酶聚集体;利用5mL的10mg/mL果胶酶CLEAs悬浮液对沤麻液(含罗布麻皮1g)在45℃水浴中脱胶8h,可以使其残胶率降至4.61%;利用交联果胶酶聚集体对沤麻液进行10次脱胶实验后,其残胶率仍可保持在11.25%以下,可重复利用性较高。

交联草酸脱羧酶聚集体的制备及其性质

为了获得缓解泌尿系统草酸盐结石病症的酶制剂,用无载体固定化方法——交联酶聚集体(CLEAs)制备交联草酸脱羧酶聚集体。使用基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK诱导表达制备草酸脱羧酶粗酶液,用30%的乙醇进行沉淀分离提纯,纯化倍数为2.7倍,酶活回收率91.2%;在戊二醛添加量为0.06%、pH5、牛血清白蛋白添加量0.5g/L、4℃的条件下处理该酶2h,得到交联草酸脱羧酶聚集体(oxdc-CLEAs),酶活回收率达95.4%;酶学性质研究表明,相对游离草酸脱羧酶,交联草酸脱羧酶聚集体的耐酸性、耐热性、耐胰蛋白酶降解能力均有提高。

磁响应交联糖化酶聚集体的制备及催化特性

提出了一种采用羧基磁性纳米粒子制备杂化磁响应交联酶聚集体(M-CLEAs)的方法。表面羧基修饰的约10 nm的磁性纳米粒子与酶分子表面的氨基位点通过静电相互作用,形成复合物,在磁场作用下可将磁性纳米粒子-酶复合物从溶液中分离,经戊二醛交联即形成M-CLEAs。传统的表面氨基修饰的磁性纳米粒子与酶需在沉淀剂作用下,从溶液中分离,而后采用戊二醛共交联,而本方法无须沉淀剂,过程更为简化。以糖化酶为对象,对该过程的影响因素(交联时间、pH、酶浓度、戊二醛浓度等条件)进行了探索,并对制得的M-CLEAs的酶学性质进行了较为详细考察。结果表明,最优制备条件为:酶浓度1 mg·ml-1,磁流体浓度10 mg·ml-1,戊二醛浓度0.25%(质量体积比),在pH 6.0下交联反应6 h,最终载酶量可达80 mg·g^(-1)、比活为50 U·mg^(-1)。制得的固定化酶pH稳定性、热稳定性和储存稳定性均显著改善,可实现糖化酶重复使用10次,仍保留接近60%的酶活。

添加纳米粒子对脂肪酶交联酶聚集体活性及结构的影响

将纳米TiO2、纳米MgO和纳米Cu分别引入假丝酵母脂肪酶(Candida sp.1619)的交联酶聚集体(CLEAs)制备过程,获得相应的纳米粒子-CLEAs,采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分析仪(SLP)等分析了纳米粒子对CLEAs活性和结构的影响。结果表明与未加纳米粒子的CLEAs相比,适量纳米TiO2的加入可提高CLEAs的酶活,最大增加15.2%;而不管添加浓度大小,纳米MgO、纳米Cu对CLEAs酶活均有抑制作用,酶活下降63.7%~97.9%。SEM、SLP分析结果表明,与未添加纳米粒子时相比,加入纳米TiO2的CLEAs粒径变小,粒度较均匀,孔道增加;而纳米MgO-CLEAs和纳米Cu-CLEAs则出现粒度不均匀性增加、粒径范围扩大、孔道减少的现象。FTIR分析结果表明,加入3种纳米粒子后CLEAs二级结构中有序结构(α-螺旋、β-折叠)/无序结构(β-转角、无规则卷曲)值显著提高,顺序为纳米TiO2-CLEAs(0.55)>纳米MgO-CLEAs(0.43)>纳米CuCLEAs(0.35)>CLEAs(0.28),这与纳米粒子-CLEAs酶活顺序不一致,表明纳米粒子可能还存在其他影响CLEAs酶活的途径。