交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用

基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术,从白色念珠菌Candida albicans基因组中克隆了一条新型醇脱氢酶(CADH)基因,并在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中表达。为克服游离酶稳定性差、不能重复使用的缺点,探索并优化了交联醇脱氢酶聚集体(CLEAs-CA)的制备条件。结果表明:重组CADH对底物四氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的比活力为1.8 U/mg,产物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)的对映体过量值大于99%。CLEAsCA沉淀剂选择为60%饱和度的(NH_4)_2SO_4,交联剂为10 mmol/L戊二醛。在固定化操作前,加入50 mmol/L异丙醇和0.1 mmol/L NAD^+对CADH催化活性位点、辅酶结合位点进行保护,CLEAs-CA的活力回收率提高了48.3%。将CLEAs-CA用于不对称合成(R)-CHBE,经过19次的重复使用,CLEAs-CA的活性仍保留有50%。