加工过程对小麦及其制品中细交链孢菌酮酸含量的影响

细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid,TeA)是由链格孢霉(Alternaria species)产生的次级代谢产物,是链格孢霉毒素中的一种,主要污染果蔬、谷物、坚果及其制品.在众多的链格孢霉毒素中,TeA毒性最强,且在各类食品中检出率和检出浓度最高.在日常生活中,食用被TeA污染的果蔬和谷类食品可能会对消费者的健康造成威胁.目前,在全世界范围内,加工过程对谷物及其制品中细交链孢菌酮酸含量影响的研究比较少,本研究的目的是探索加工过程对小麦及其制品中细交链孢菌酮酸含量的影响.以天然TeA高污染的小麦为研究对象,将小麦加工制成面粉和麸皮,再将面粉进一步加工成面条、馒头和面包3种面制品,采用建立的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法分析小麦及其制品中TeA的含量.研究结果表明,TeA高污染的小麦经过磨粉后,其面粉中TeA含量比小麦籽粒中降低63.7%,说明磨粉可以降低小麦籽粒中可食用部分的TeA含量.在3种面制品(面条、馒头和面包)中,经过焙烤加工的面包中TeA含量下降的幅度(37.5%)大于面条(4.11%)和蒸制的馒头(3.92%),且TeA含量变化显著(P<0.05).本文研究了小麦及其面制品中TeA在加工过程中的含量变化,以期为谷类食品中TeA限量制定以及风险评估提供技术支撑.

利用秀丽隐杆线虫模型研究细交链孢菌酮酸(TeA)与4种真菌毒素的联合毒性

细交链孢菌酮酸(TeA)作为一种新兴真菌毒素,污染广泛,对人和动物可能存在多方面毒性作用,但毒理学数据十分有限,暂未被立法监管。此外,TeA常与赭曲霉毒素A(OTA)、伏马菌素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、白僵菌素(BEA)等真菌毒素共存于粮食谷物、果蔬坚果中,但其联合毒性效应也未见报道。本研究基于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)模型,初步研究了TeA单独暴露对线虫体长、产卵量、头部摆动及身体弯曲频率、脂肪沉积量、摄食量、ATP水平、活性氧(ROS)水平和过氧化氢酶(CAT)活性的影响,以及TeA分别与OTA、FB1、ZEN、BEA联合对线虫的毒性效应。研究表明,当TeA浓度为6.25~25 mg·L^(-1)时,对秀丽隐杆线虫的生长发育、生殖能力、神经系统、代谢能力存在明显的毒性损伤并可导致机体产生氧化应激,且呈剂量-反应关系。随后,采用Chou-Talalay模型对联合毒性进行评价发现,TeA分别与OTA、FB1、ZEN、BEA联合暴露对线虫生长发育和生殖能力的影响随毒素浓度和暴露时间的变化呈现不同的相互作用效应。其中TeA+OTA、TeA+FB1对体长(24 h)以及TeA+ZEN对产卵量的毒作用随暴露浓度的增加一直呈协同作用,而TeA+OTA对产卵量的毒作用随暴露浓度的增加,由一般拮抗变为协同作用。基于此,本研究结果不仅在一定程度上丰富了TeA的毒理学数据,还为进一步开展TeA风险评估和相关食品安全标准的制定提供科学依据。

细交链孢菌酮酸酶联免疫吸附分析方法研究

采用水合肼和乙醛酸依次对细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)进行衍生化,设计合成了含有氮杂共轭双键偶联手臂,可增强免疫效果的半抗原TeAHGA。通过偶联载体蛋白BSA后的免疫原TeAHGA-BSA免疫新西兰大白兔,成功制备了特异性识别TeA水合肼衍生物TeAH的多克隆抗体;优化确立了ELISA最佳反应条件(TeAH-OVA为异源包被原、包被浓度0.156"g/L、药物稀释及反应缓冲液为PBS、一抗反应时间40min、二抗反应时间20min),建立了TeA间接竞争ELISA(icELISA)检测方法,其抑制中浓度(IC50)为1.61"g/L,检出限(LOD)为0.08"g/L,定量线性检测范围为0.19～12.89"g/L(IC20～IC80)。番茄、面粉样品平均添加回收率分别为67.2%～89.8%和74.8%～93.7%。

链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草的致病性

以空心莲子草离体叶片和植株为材料,采用离体叶片针刺法及离体植株培养法研究链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草的致病性。结果表明,细交链孢菌酮酸对空心莲子草叶片具有较强的致病性。在31.25～500.00μg/mL浓度范围内,随着毒素浓度的升高,空心莲子草叶片的病斑直径增大,500.00μg/mL时为2.41mm;浓度为20.00μg/mL时,毒素对空心莲子草植株不同部位叶片的致病性存在差异,对幼嫩的顶部叶片致病性较强;细交链孢菌酮酸对空心莲子草植株的生长产生抑制作用,抑制强度随浓度的升高而增强,与对照相比,当浓度达到125.00μg/mL时,毒素对植株生长的长度、鲜重及平均根长的抑制作用达到显著水平,浓度达到250.00μg/mL时,植株的生根数也受到显著抑制,在最高浓度500.00μg/mL时,植株处于零生长,生长长度和生根数均为0,鲜重为负增长,达-0.77g。本研究表明细交链孢菌酮酸具有开发为防除空心莲子草生物源除草剂的潜力。

链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草叶片生理生化特性的影响

以空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)成株为材料,采用植物抗性生理分析测定技术研究了链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对空心莲子草叶片细胞膜透性、叶片内MDA含量、SOD、POD和CAT酶活性变化的影响。结果表明,空心莲子草叶片经细交链孢菌酮酸处理后,细胞膜透性随着细交链孢菌酮酸浓度的增加而增高,MDA含量在500μg/ml以下,随着毒素浓度的增加而升高,500μg/ml以上,又有所下降;随着细交链孢菌酮酸浓度的升高,SOD、POD、CAT活性下降,与对照相比,在1 000μg/ml时,SOD、POD和CAT活性达到最低,分别比对照(CK1)活性降低了86.24%、72.72%和82.05%。可见,细交链孢菌酮酸可严重降低空心莲子草叶片的生理生化活性,显示了其生防潜力。

细交链孢菌酮酸人工抗原的制备

对链格孢霉菌毒素中危害最大的细交链孢菌酮酸进行设计和修饰,系统研究载体、蛋白和偶联方法与条件,结合人工抗原纯化、鉴定的结果,分析影响免疫原合成的各种因素,确定碳二亚胺法偶联细交链孢菌酮酸与牛血清白蛋白可获得偶联比为9.7:1的人工抗原,能够满足动物免疫需求。

同位素稀释-液相色谱-串联质谱法在小麦粉细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质制备和定值中的应用

建立了小麦粉中细交链孢菌酮酸(TeA)和腾毒素(TEN)标准物质的研制和定值方法,为开展粮食中交链孢霉毒素基体标准物质的研制提供重要方法学借鉴。该标准物质样品为天然污染交链孢霉毒素的小麦籽粒,定值目标物为TeA和TEN,采用同位素稀释-液相色谱-串联质谱法(ID-LC-MS/MS)进行定值测量,多个实验室合作定值。所研制的标准物质具有常温避光保存、定值不确定度小等特点。该标准物质是目前国际上唯一一种天然污染TeA和TEN的小麦粉标准物质,可用于食品安全风险监测、产品质量检测等领域相关分析方法的评价和测量质量控制等。

γ射线对溶液中交链孢菌酮酸降解效果的研究

目的探讨γ射线辐射对溶液中交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)的降解效果,为辐射技术用于控制食品中的真菌毒素提供理论及实践依据。方法以TeA标准溶液确定高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法的线性关系、检测限、定量限和精密度;采用^(60)Coγ射线辐射降解溶液中的TeA,基于HPLC方法研究辐照剂量、初始浓度、溶剂组成和辐照剂量率对溶液中TeA的降解效果及其降解规律。结果当TeA标准溶液浓度在0.05~5μg/mL范围时,TeA浓度与液相色谱峰面积间线性方程为Y=110.46X+0.3044,决定系数为0.9999。方法的检测限为0.008μg/mL、定量限为0.02μg/mL,仪器精密度的相对标准偏差小于2%。辐照剂量、溶液中TeA的初始浓度、溶剂组成以及辐照剂量率均影响溶液中Te A的降解率。以纯甲醇为溶剂的TeA降解率远低于溶剂中含有水的TeA降解率。在低辐照剂量率处理条件下,溶液中TeA的降解效果明显高于高辐射剂量率中的降解效果。结论γ射线辐射对溶液中的TeA具有良好的降解效果,为后续去除复杂食品基质中的TeA污染提供了理论支撑。

链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸在土壤中的降解研究

细交链孢菌酮酸是病原真菌链格孢菌(Alternaria sp.)产生的主要毒素之一,在霉变的粮食、感病的植物和腐烂的水果中都能检测到,其具有较强的动物毒性,给食品安全带来一定的隐患。分别在实验室和大田条件下对链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸在土壤中的降解动态进行了观察。结果表明,在实验室条件下,微生物对细交链孢菌酮酸在土壤中的降解影响较大,光照的影响较弱,不灭菌条件下,其半衰期小于10d,加药10d时,其降解率就大于50%;灭菌条件下,其半衰期大于30d,加药40d时,其降解率才超过50%。土壤含水量的增加和土壤温度在一定范围内的升高可促进其降解,土壤含水量为12.5%￣50%,其半衰期为11.38￣5.14d,加药10d时其降解率为38.98%￣62.14%,温度为20￣40℃时,其半衰期为14.26￣5.11d,加药10d时其降解率为36.94%￣62.45%。田间研究表明,细交链孢菌酮酸在自然条件下降解的半衰期约为3.22d,20d后就可完全降解。可认为细交链孢菌酮酸属于易降解类物质。

链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对蚕豆根尖细胞微核和有丝分裂的影响

利用蚕豆根尖为材料,研究了链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对细胞微核和有丝分裂的影响,以评价其细胞遗传毒性.结果表明,当浓度为12.5～50μg/mL时,细交链孢菌酮酸对蚕豆根尖细胞微核率和有丝分裂指数不产生显著影响,微核率低于3‰,有丝分裂指数超过9.5%.浓度升高到100～400μg/mL时,细交链孢菌酮酸使蚕豆根尖细胞微核率显著升高,有丝分裂指数显著下降,其中,400μg/mL时,微核率高达36.01‰,有丝分裂指数仅为1.90%.当细交链孢菌酮酸浓度为12.5～100μg/mL时,与对照相比,蚕豆根尖细胞多核仁率无显著差异,多核仁率低于3‰;浓度升高到200～400μg/mL时,细胞多核仁率显著升高,400μg/mL时,多核仁率高达26.10‰.

间接竞争化学发光酶联免疫分析法检测番茄酱和果汁中异细交链孢菌酮酸

针对番茄酱和果汁中链格孢霉菌毒素污染问题,建立异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,ITe A)间接竞争化学发光酶联免疫分析法。通过棋盘法和单因素试验确定最佳包被原质量浓度为15.6 ng/m L、抗体质量浓度为稀释96 000倍、缓冲体系pH 7.4、竞争反应时间和二抗反应时间分别为40 min和50 min。方法IC50为2.13 ng/m L,线性范围为0.50~9.12 ng/m L,检测限为0.10 ng/m L,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%,样品添加回收率在78.60%~110.83%之间,变异系数均小于15%。本方法适用于样品中ITe A污染的特异性快速筛查。

狭卵链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸诱导稗草叶片氧化胁迫和抗氧化酶变化的研究

[目的]确定细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)对稗草的毒害作用是否与其诱导氧化胁迫及抗氧化酶活性变化有关。[方法]通过离体试验研究了TeA处理稗草叶片丙二醛和过氧化氢含量及抗氧化酶活性的变化。[结果]稗草叶片经500μmol/L TeA处理后,叶片中丙二醛和过氧化氢含量分别较对照增加了247.86%和67.00%,表明TeA处理诱导了稗草叶片中活性氧暴发,并导致丙二醛和过氧化氢的大量积累。TeA引起超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶(CAT)活性显著升高,其中在500μmol/LTeA处理下,稗草叶片SOD、GR和CAT活性均较对照增加1倍以上。[结论]TeA诱导活性氧的产生引起稗草叶片氧化胁迫,同时诱导叶片抗氧化酶活性升高。

利用HPLC法测定链格孢菌培养液中细交链孢菌酮酸的含量

改进了一种利用反相高效液相色谱检测链格孢菌菌液中细交链孢菌酮酸的方法。样品经过大孔树脂和硅胶处理之后进行检测,色谱柱为ODS-C18反相柱,流动相为100%甲醇,流速为0.4ml/min,检测波长为280nm。选用外标法进行定量。细交链孢菌酮酸标准品峰面积的自然对数与其相应浓度的自然对数呈良好的线性关系,方法检测精密度RSD为0.44%,回收率大于95%,细交链孢菌酮酸的出峰时间在6min左右。检测细交链格孢菌培养液中细交链孢菌酮酸的平均含量为1.7395μg/ml。

链格孢菌产细交链孢菌酮酸条件的优化研究

鉴于链格孢霉毒素细交链孢菌酮酸(TeA)对防治月季长管蚜有明显效果,为了进一步开发利用TeA,对1株链格孢菌(编号5390)产TeA的条件进行研究,通过单因素试验的方法,研究了不同培养基、不同培养温度、不同培养时间及不同光照条件对TeA含量的影响,在此基础上用响应面对链格孢菌产毒条件进行优化。结果表明产TeA的最佳条件为:理查培养基,黑暗培养,温度30℃,培养时间29 d。在此条件下进行试验验证,TeA含量为14.99μg/g,与模型预测接近。对链格孢属真菌产TeA的培养条件进行筛选,探索真菌培养方式获得链格孢菌毒素TeA的方法,将有利于TeA的进一步开发利用。

细交链孢菌酮酸及其衍生物的合成与杀虫活性

为了寻找具有较高杀虫活性的特胺酸化合物,以天然活性产物细交链孢菌酮酸(TeA)作为先导化合物,利用酰基化米氏酸作为酰基化试剂,设计、合成了26个3-位不同酰基取代和5-位不同取代的含特胺酸骨架衍生物4a~4s、5a~5g、7a和8a,其中14个化合物未见文献报道,所有目标化合物的结构均经核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱确证。初步杀虫活性测定结果表明,在100μg/mL下处理72 h内,所有目标化合物对麦长管蚜Macrosiphum avenae(Fabricius)均表现出良好的杀虫活性,并具有内吸性,其中化合物5d和7a 48 h致死率为100%,高于对照药剂螺虫乙酯,具有作为先导化合物进一步研究的价值。对处理后的小麦植株进行残留量测定,结果表明目标化合物4e、5c、7a和8a能被植株较好的吸收。该研究结果可为进一步研究具有特胺酸骨架化合物的构效关系提供参考。

细交链格孢菌酮酸间接竞争酶联免疫检测方法及配套试剂盒的研制

建立了间接竞争酶联免疫吸附法检测食品中细交链格孢酮酸(Tenuazonic Acid,TA)残留,并研制快速检测试剂盒。采用肟化法对TA进行衍生化,活泼酯法偶联半抗原和载体蛋白得到人工抗原TAO-BSA和TAO-KLH,以TAO-KLH作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠制备特异性抗体。对包被浓度、包被时间、封闭液类型、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等参数进行研究,建立了TA残留间接竞争酶联免疫检测方法并进行了配套试剂盒的研制。该试剂盒半抑制浓度Ic_(50)为1.48ng/mL,检测线性范围为0.06~35.95ng/mL(R^2=0.9941);检测限为0.02ng/mL;加标样品平均回收率大于88.50%;试剂盒的批间和批内平均变异系数分别为2.84%和9.49%,与食品中常见真菌毒素交叉反应率均小于1%。

小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质的研制

目的研制小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质。方法利用天然污染交链孢霉毒素的小麦样籽粒制备,按照规定的定值程序,形成符合国家相关要求的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质。结果研制成功2个不同浓度水平的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质,并获批国家二级标准物质[标准号:GBW(E) 100547和GBW(E) 100548]。结论该标准物质是目前国际上唯一的天然污染细交链孢菌酮酸和腾毒素的小麦粉标准物质,研制过程为我国开展粮食中新型真菌毒素基体标准物质的研制提供重要方法学借鉴。

狭卵链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸对稗草细胞膜脂质过氧化作用的影响

为明确狭卵链格孢菌Alternaria augustiovoide菌株AAEC05-3产生的毒素细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)的作用机制,利用离体试验,研究了TeA对稗草叶片细胞膜脂质过氧化的影响。结果显示,低浓度TeA处理对稗草叶片的细胞膜透性和脂质过氧化影响不大;用高浓度TeA处理稗草叶片24 h后,稗草叶片细胞膜透性和脂质过氧化作用显著增强。TeA浓度为100μmol/L时,稗草叶片相对电导率和丙二醛(MDA)含量分别增加28.21%和63.58%;脂氧合酶(Lox)活性增高61.59%,且不饱和脂肪酸含量显著降低,亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)分别降低19.56%和17.20%,脂肪酸氢过氧化物在叶片中大量积累。表明TeA可以诱导稗草叶片细胞膜的脂质过氧化作用。

基于光谱法研究异细交链孢菌酮酸半抗原-抗体的相互作用

本文采用紫外可见光谱(UV-Vis)、荧光光谱和圆二色谱(CD)技术研究了异细交链孢菌酮酸单克隆抗体(Mc Ab)与其半抗原(Ite AH)之间的相互作用并用ELISA方法对荧光结果进行了验证。结果表明,ITe AH对Mc Ab有荧光猝灭作用,淬灭机理主要为静态猝灭且遵循非辐射能量转移理论。在298、310、318 K 3个温度下,ITe AH与Mc Ab的结合常数分别为1.9×106、1.6×106、1.4×106 L/mo L,结合位点数n≈1,结合距离r为3.35 nm,经ELISA测得的结合常数与荧光分析的结果较一致。由结合作用过程的热力学参数可知,两者之间以静电引力为主要作用力,不同p H下,由ELISA结果可推测其影响了ITe AH与抗体结合。同步荧光光谱显示ITe AH的加入并未使抗体的酪氨酸和色氨酸残基附近的微环境发生明显改变,两者的结合位点更倾向于酪氨酸残基,圆二色谱分析发现ITe AH与Mc Ab相互作用后,抗体的二级结构发生明显变化。

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展

链格孢霉(Alternara)是污染食品和饲料最普遍的真菌之一。细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物。本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化险质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望。