QuEChERS-HPLC-MS/MS法测定中药中4种交链孢霉毒素

样品用1%甲酸-乙腈溶液提取,经N-丙基乙二胺(PSA)净化,采用BEH-C 18色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,采用电喷雾离子源负离子模式扫描,多反应模式(MRM)监测目标物,内标法定量。4种交链孢霉毒素在0.200~200 ng/mL的范围内呈现良好的线性关系(R 2≥0.999),并以西洋参为例做方法学验证。该方法还可应用在铁皮石斛、薏仁、陈皮、莲子和橄榄这五种基质中。该方法操作简单快捷,可用于中药中4种交链孢霉毒素的检测。

超高效液相色谱-串联质谱法测定葵花籽中4种交链孢霉毒素的含量

取2.5g已粉碎的葵花籽样品,加入500.0μL含100.0μg·L^(-1)交链孢酚单甲醚-d_(3)(AME-d_(3))、1000.0μg·L^(-1)滕毒素-d_(3)(TEN-d_(3))和交链孢酚-d_(2)(AOH-d_(2))、5000.0μg·L^(-1)细交链孢菌酮酸-d_(13)(TeA-d_(13))的混合内标溶液,混匀,放置过夜,用25.0mL体积比为45∶10∶45的乙腈-甲醇-0.05mol·L^(-1)磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)混合液振荡提取,离心。取上清液,用水定容至30.0mL,分取6.0mL,加入15.0mL 0.05mol·L^(-1)磷酸二氢钠溶液(pH 3.0),过Waters Oasis HLB固相萃取柱(预先用5.0mL甲醇和5.0mL水活化),用20%(体积分数)甲醇溶液淋洗,抽干固相萃取柱,用10mL体积比为1∶1的含1%(体积分数)氨水的甲醇-乙腈混合液进行洗脱。将洗脱液于40℃氮吹至近干,残渣用200.0μL甲醇复溶,并用水定容至2.0mL,所得溶液采用超高效液相色谱-串联质谱法测定其中交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)、细交链孢菌酮酸(TeA)和腾毒素(TEN)等4种交链孢霉毒素的含量,内标法定量。结果表明,Waters Oasis HLB固相萃取柱净化效果最佳,在洗脱剂中加入氨水有利于改善峰形,基线更平滑;4种交链孢霉毒素的质量浓度在一定范围内与对应的峰面积和内标峰面积的比值呈线性关系,测定下限(10S/N)为0.15~1.50μg·kg^(-1)。按照标准加入法进行回收试验,回收率为75.0%~112%。对实际样品做7组平行,测定值的相对标准偏差均小于13%。方法用于实际样品分析,结果显示检出率和检出量最高的是TeA,平均值为1890.16μg·kg^(-1),TEN次之,平均值为20.26μg·kg^(-1)。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定粮食中4种交链孢霉毒素

为同步测定大米、玉米和小麦中4种交链孢霉毒素,本研究建立了相应的超高效液相色谱-串联质谱法。试样中交链孢霉毒素用酸化乙腈水溶液提取,经HLB固相萃取柱净化后,以ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm,2.1 mm×100 mm)为分析柱,以0.55 mmol/L氨水水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,以负离子电喷雾模式电离(ESI-),多反应离子监测(MRM)方式进行定性和定量检测,外标法定量。在本方法条件下,4种交链孢霉毒素在3种基质中线性范围内均呈现良好的线性关系(R^(2)>0.9900),方法检出限0.4~4.0μg/kg,定量限1.0~10.0μg/kg。在3种加标水平下,4种毒素的回收率范围为62.50%~113.40%,相对标准偏差RSD≤7.89%。采用建立的方法检测了市售大米和小麦中的4种交链孢霉毒素,大米中4种毒素的污染水平为ND~12.18μg/kg,小麦中为ND~163.32μg/kg,本方法可满足实际样品的检测。

固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中4种交链孢霉毒素含量及其分布状况

目的:建立固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中4种交链孢霉毒素含量的方法并描述其在橄榄油中的分布状况。方法:将橄榄油混匀后取5 g(精确至0.001 g),经乙腈-磷酸二氢钠溶液混合溶液提取,固相萃取柱净化,收集净化液经水浴氮吹浓缩后,采用超高效液相色谱质谱仪测定,内标法定量。结果:交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)在0~50 ng/mL、交链孢酚(alternariol, AOH)在0~20 ng/mL、腾毒素(tentoxin, TEN)在0~10 ng/mL、交链孢酚单甲醚(alternariol methyl ether, AME)在0~2 ng/mL范围内线性良好(R>0.99)。TeA、AOH、TEN、AME的检出限在0.20~2.00μg/kg范围之间。4种生物毒素加标回收率为92.25%~124.66%,精密度范围3.79%~10.58%,表明本方法样本检测量小、灵敏度高、准确度高、精密度高,重现性好,是检测橄榄油中交链孢霉毒素的理想方法。结论:橄榄油普遍受到交链孢霉毒素污染,检出率93.33%(28/30),AME毒素是橄榄油中最主要的检出毒素。

河南林县居民粮食中互隔交链孢霉及其毒素污染和人群暴露状况研究

背景与目的:调查林县居民粮食中互隔交链孢霉(Alternariaalternata)污染情况及人群中互隔交链孢霉有关毒素-交链孢酚(Alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(alternariolmonomethylether,AME)暴露水平,探讨互隔交链孢霉毒素污染与林县食管癌发生的关系。材料与方法:对林县居民粮食及尿样中互隔交链孢霉做分离培养,采用薄层层析(TLC)法检测AOH和AME,并与本室10年前相应检测结果比较。结果:①2004年小麦中互隔交链孢霉污染率与1981年相比差异具有统计学意义(χ2=359.283,P<0.01)。②2004年小麦中AOH阳性率低于1995年(χ2=5.152,P<0.05)。③2004年小麦面粉中AOH阳性率低于小麦原粮(χ2=5.128,P<0.05)。④2004年99份尿液中4份AOH阳性,1份AME阳性,明显低于1992年检测结果,其差异均有统计学意义(χ2=7.082,P<0.01;χ2=14.282,P<0.01)。结论:2004年河南林县居民粮食中互隔交链孢霉及其相关毒素污染状况有不同程度的减轻。此与当地食管癌发生率的降低可能有一定的关系。

固相萃取净化-超高效液相色谱串联质谱法测定菜籽油中交链孢霉毒素含量

建立了固相萃取净化-超高效液相色谱串联质谱法测定菜籽油中交链孢霉毒素含量的方法。将菜籽油与甲醇混匀后使用Captive EMR-Lipid固相萃取柱(3 mL,300 mg)净化,收集净化液经氮吹浓缩后,采用超高效液相色谱串联质谱测定,内标法定量。以回收率为指标对固相萃取柱的净化载量及洗脱剂体积进行优化。结果表明,菜籽油最佳净化载量为0.15 g,最佳洗脱剂体积为2.0 mL。4种交链孢霉毒素在线性范围内相关系数均大于0.998,4种交链孢霉毒素加标回收率为68.8%~117.3%,精密度为8.6%~11.4%,方法检出限为0.1~2.0μg/kg,定量限为0.3~6.0μg/kg。方法具有较好的灵敏度及回收率,简单、易于操作,适用于菜籽油中交链孢霉毒素的检测。

大骨节病区粮食中互隔交链孢霉产毒菌株的测定

链格孢霉属(Alternaria)是侵染田间多种作物和收获后谷物的常见真菌之一,不仅产量和品质下降,而且产生毒素,有害于人、畜的健康。Serter(1984)从小麦和高粱上分离的互隔交链孢霉(A.aiternata)产生主要存毒代谢物为互隔交链孢霉醇(Alternariol,AOH)和互隔交链孢霉醇单甲醚(Al-ternariol Melthy Ether,AmE)等。近年来,我国白逢彦等(1990)和郭雄等(1995)分别在青海和陕西大骨节病病区粮食中进行真菌学检查。

交链孢霉甲基醚(AME)对软骨细胞代谢的影响

本文应用AME作用于培养的兔关节软骨细胞,动态观察其对软骨细胞生长代谢的影响。结果表明AME对软骨细胞DNA含量无明显影响,而能使软骨基质中葡萄糖醛酸(GlcUA)含量降低,在培养第9日AME与葡萄糖醛酸含量呈显著负相关关系。提示AME对软骨组织的毒性作用,在于抑制成熟期软骨细胞合成和分泌蛋白多糖。

交链孢霉对速克灵的抗药性研究

Alternaria solani和A.citri在含速克灵10～50微克/毫升的PSA培养基上培养7-10天,很容易获得抗药水平很高的抗性突变体。这种突变体对异菌脲有交互抗药性,但其致病力有所下降。具有高抗水平的抗药突变体在无药条件下培养不易丧失抗性。

蒜薹交链孢霉菌的生物学特性研究

对已分离的蒜薹交链孢霉菌的生物学特性进行测定,结果表明:蒜薹交链孢霉菌对碳源的利用以葡萄糖为最佳;生长的适宜温度范围为5℃～40℃,最适为28℃;光暗交替对菌落生长有促进作用;生长的适宜pH值范围为2.5～12.5,最适为8.5。该菌在乳糖中最易产孢;产孢的适宜温度范围是30℃～35℃,最适为35℃;光暗交替对交链孢霉产孢有促进作用;产孢初始适宜pH值范围为4.5～12.5,最适为8.5。

真菌类及其毒素在人食管癌中的病因学意义互隔交链孢霉与食管癌发生关系的研究

河南省林县为食管癌高发区,发病率之高居世界之冠,它严重地威胁着人民健康。要预防食管癌,研究食管癌病因是十分重要的。关于食管癌的病因,国外强调饮酒、吸烟、热食、亚(?)胺、微量元素缺乏、营养不足和遗传因素的作用。关于霉菌在食管癌病因学中的作用,仅南非有几篇研究粮食中霉菌毒素的报道。

交链孢霉代谢产物的致畸致突变致癌作用

对霉菌与肿瘤的关系,目前已引起国内外的广泛注意。近年来,国内一些学者提出霉菌可能是我国食管癌的致病因素之一,这一学说已为国外一些专家所关注。1978年,甄应中等对河南食管癌高、低发地区8个县的粮食抽样检测。

防腐剂对红提葡萄中灰葡萄孢霉和交链孢霉抑制效果初探

研究了25种防腐保鲜剂对红提葡萄中灰葡萄孢霉和交链孢霉的抑制效果。结果表明,抑制灰葡萄孢霉,过氧乙酸、双氧水、对羟基苯甲酸乙酯的能力最强,次氯酸钠、冰醋酸,新洁尔灭、蜂胶、扑海因和次亚磷酸钠的抑制能力相对较弱;抑制交链孢霉,扑海因、新洁尔灭、对羟基苯甲酸乙酯能力最强,过氧乙酸、双氧水、次氯酸钠和冰醋酸,蜂胶和次亚磷酸钠抑制能力相对较弱;其它药剂如苯甲酸钠、山梨酸钾、蔗糖脂肪酸酯、壳聚糖等对上述两种霉均无抑制效果。

粮油制品中交链孢霉毒素的测定

采用玉米赤霉醇(Zearalanone,Zea)作为内标物,建立了液相色谱串联质谱法(LC/MS-MS)ESI-食品中的3种交链孢霉毒素的测定方法。优化了样品的前处理方法,对比了液液萃取与Micostep226、C18等2种SPE柱对提取液的净化效果,其中液液萃取法对提取液进行萃取回收率最高。方法的线性范围在0.48～480ng/mL之间,检出限在0.12～1.2ng/mL之间。采用所建立的方法对深圳市场销售的大米、花生、植物油等制品进行分析,均未检出3种交链孢霉毒素。对大米与植物油样品2个浓度水平的加标实验,回收率在60.4%～87.2%之间,RSD在7.6%～14.8%之间。

使用交链孢霉建立小鼠过敏性哮喘模型

目的探讨使用交链孢霉过敏原建立小鼠过敏性哮喘模型的可行性。方法 24只Balb/c小鼠随机分为对照组与实验组,每组12只;实验组用交链孢霉提取液在乙醚麻醉下滴鼻致敏与激发,交链孢霉致敏浓度25μg/ml,100μl分两次滴鼻,激发浓度为50μg/ml,操作同前。观察3 d后,在第4、5、6、7天连续4 d致敏,第18、19、20天及第36、37、38天进行激发;对照组用生理盐水代替。通过观察末次激发后小鼠的活动表现,检测小鼠气道反应性,肺泡灌洗液细胞分类计数,血清总Ig E和特异性Ig E水平,肺泡灌洗液中白介素(interleukin,IL)-4、IL-10、干扰素(interferon,IFN)-γ水平,肺组织中IL-25 m RNA与IL-33 m RNA表达水平及肺组织病理切片以验证模型的有效性。结果与对照组相比,实验组小鼠末次激发后均出现抓耳挠腮、呼吸急促、焦躁不安或安静少动等异常表现,并且需要更久的时间恢复正常;实验组小鼠气道阻力增加[(0.87±0.17)、(2.96±0.24)、(10.57±2.33)、(13.26±5.79)、(16.40±6.52)cm H2O/(ml·s),P<0.05或P<0.01]、气道顺应性降低[(0.280±0.160)、(0.150±0.092)、(0.053±0.031)、(0.046±0.022)、(0.037±0.009)ml/cm H2O,P<0.05或P<0.01],肺泡灌洗液的细胞总数[(21.28±4.58)×105/ml]和嗜酸性粒细胞比例(68.33%±17.80%)明显增多(P<0.01),血清总Ig E[(883.94±122.33)ng/ml]和特异性Ig E[(65.76±15.56)ng/ml]及肺泡灌洗液的IL-4[(109.14±42.51)pg/ml]水平明显偏高(P<0.05或P<0.01),IFN-γ[(93.42±51.26)pg/ml]的水平偏低(P<0.01),肺组织中IL-33 m RNA表达水平(2.21±0.58)亦明显增高(P<0.01);IL-25 m RNA表达水平在实验组与对照组均未检测出。结论交链孢霉致敏Balb/c小鼠的实验结果符合过敏性哮喘模型的变化。

速克灵对马铃薯早疫交链孢霉的毒力研究

速克灵(又名二甲菌核利)对马铃薯早交链孢霉(Alternaria solani)在PSA培养基上的生长有强烈的抑制作用。药剂浓度对教(X)与菌丝生长抑制机率值(Y)成直线关系,相关系数r=0.981(n=8时,r_(0.01)=0.834),回归方程“y=5.0984+1.1147x”。EC_(50)为0.186微克/毫升,毒力比常规药剂克菌丹、百菌清高29-30倍。速克灵处理番茄离体叶片和盆栽小苗,浓度分别为每毫升50微克和250微克即可完全抑制病菌的侵染。

河南省食管癌高低发区粮食中互隔交链孢霉毒素的化学检测

互隔交错孢霉毒素从随机采集于食管癌高低发区粮食样品中被提取后,用化学方法纯化,再经薄层层析(TLC)检测。结果显示:高低发区粮食中毒素的阳性率有显著差异,提示高发区互隔交链孢霉毒素在粮食中的广泛存在与食管癌的发生有密切关系。

食管癌高低发区人群尿互隔交链孢霉素排出水平的研究

本文报道了薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对食管癌高低发区人群尿中互隔交链孢霉毒素的测定结果,从高发区40例尿液中检出7例阳性,阳性率为17.5％。最高含量AME为5.476μg/夜尿,AOH为12.813μg/夜尿。低发区商丘和郑州市各20例中均未检出。结果表明,高发区人群尿排出水平高于低发区,食管癌的发生可能与摄入互隔交链孢霉毒素有重要关系。

互隔交链孢霉素AME、AOH天然品、人工合成品TLC鉴定

霉菌毒素在肿瘤病因学中的作用日益受到人们的重视。互隔交链孢霉毒素是继黄曲霉毒素被证明具有致肝癌作用之后又一个引起肿瘤病因研究者关注的霉菌毒素。食管癌高发区林县粮食中互隔交链孢霉的污染率及其毒素的检出率均高于低发区商丘相应粮食中的污染率及其毒素检出率。该菌培养物的粗提物又具有诱变作用和细胞转化作用。

林县互隔交链孢霉素x_4结构鉴定

从林县粮食中分离的优势菌株互隔交链孢霉培养物中提取出七种代谢物,对其中成份之一x_4,经质谱、红外光谱、核磁共振光谱测定,同时与标准品及人工合成品作比较,证明x_4成份是交链孢酚(Alternariol AOH)。