利用交错式热不对称PCR法获取多脊椎蒙古羊Hoxc8启动子序列的研究

[目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的启动子序列,但可为今后的相关研究提供借鉴。[结论]该研究为进一步分析蒙古羊Hoxc8的启动子区域的甲基化状态奠定了基础。

利用交错式热不对称PCR法获取多脊椎蒙古羊Hoxc8启动子序列的研究(英文)

[目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的启动子序列,但可为今后的相关研究提供借鉴。[结论]该研究为进一步分析蒙古羊Hoxc8的启动子区域的甲基化状态奠定了基础。

一种新型抗菌肽基因决定簇的克隆与序列结构特征

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9菌株产生的抗菌肽BBL属于非核糖体合成肽,其生物合成涉及到一系列相关基因。为了获得完整的抗菌肽BBL基因决定簇,本研究基于部分已知的NRPS-A结构域基因序列,以S62-9菌株质粒DNA为模板,采用TAIL-PCR技术对NRPS-A结构域的上游进行扩增,得到一个大小为2.74kb的序列,该序列包含NRPS-A的5′末端序列、pp-binding序列以及1个ABC转运蛋白基因。该序列进一步与已知序列进行序列拼接及软件分析比对,最终获得一个大小为22.2kb的基因簇,该基因簇包含13个Bbl功能结构域,根据功能该基因簇分为3类功能相关基因:一类是编码转运相关蛋白,BblE包含3个ABC转运蛋白,负责抗菌肽向胞外渗透运输;二是催化短肽合成基因,Bbl F包含了pp-binding结构域和NRPS-A结构域,与氨基酸的装载和缩合有关,负责短肽的合成;三是肽链修饰相关基因,Bbl D、Bbl E、Bbl M、Bbl K等基因负责肽的修饰。

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp，编码755个氨基酸，其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku，pI值约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成；GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。

PSORA:一种基于高通量测序的T-DNA插入位点分析方法

【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法,将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)的扩增产物进行高通量测序,随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点,该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物,另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签(Barcode),用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系(L1、L6、L9、L15和L19)由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外,通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析,结果显示,L6含2个插入位点(NW_015801367的36316 bp处和NW_015950898的42202 bp处),L9、L15和L19各含1个插入位点(L9的插入位点为NW_015943682的235969 bp处;L15的插入位点为NW_015802951的60529 bp处;L19的插入位点为NW_015863435的12188 bp处),L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证,含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照,野生型(WT)作为空白对照,结果表明,在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增,该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法,可以同时分析多个插入事件,相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。

添加餐厨废油脂培养酵母进行γ-癸内酯生物转化

为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h后获得与完全培养基相当的生物量。在Y.lipolytica中过表达酰基辅酶A氧化酶基因pox2获得工程菌,将蓖麻油酸转化为GDL产量达1.5 g/L,是出发菌株的2.2倍。利用分解油脂活性高的Y.lipolytica菌株(解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)与工程菌混菌降解餐厨废弃油脂并转化蓖麻油生产GDL,最佳条件为:当C.lipolytica与Y.lipolytica工程菌的接种比例为1∶10(体积比)、接种方式为先接种C.lipolytica,28℃,振荡培养(200 r/min)12 h后再接种Y.lipolytica,混菌发酵培养基中GDL产量达0.15 g/L,显著高于工程菌单菌发酵产量0.08 g/L。结果表明,餐厨废弃油脂是廉价的碳源,通过不同菌株的混菌发酵转化生产GDL的方法具有很大的工业化应用前景。