产单核细胞李氏杆菌Lm4b_02325/26双基因缺失株构建及部分生物学特性试验

旨在构建食源性产单核细胞李氏杆菌毒力岛4(LIPI-4)中的抗转录终止子(Lm4b_02325)和未知蛋白(Lm4b_02326)基因的双缺失株,研究Lm4b_02325/26基因对产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的部分生物学特性的影响。利用同源重组技术构建LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株,测定LM928和LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株在脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)、不同EtOH浓度、不同NaCl浓度、不同pH、不同温度下的D_(600 nm),绘制生长曲线;RT-qPCR检测双基因缺失前后体外BHI培养环境下部分毒力因子转录水平;平板计数测定其对鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附、侵袭与胞内增殖情况;感染C57BL/6小鼠后检测肝、脾、脑组织中的细菌数量。结果表明,成功构建具有遗传稳定性的双缺失株LM928ΔLm4b_02325/26。在含0.5%~10%NaCl或3%~4.5%EtOH的培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异,在pH=5条件下,双缺失株的生长率显著高于野毒株,pH=9条件下双缺失株的生长率显著低于野毒株。在不同温度(4℃、37℃、42℃)BHI培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异。Lm4b_02325/26基因双缺失株在BHI培养基中毒力因子hly、inlC和PlcA极显著上调(P<0.01),mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA极显著下调(P<0.01);双缺失株对RAW264.7细胞的黏附率(14.86%)和侵袭率(2.23%)明显低于野毒株的黏附率(22.93%)和侵袭率(4.28%)(P<0.01);3、6、12 h时胞内增殖数量极显著低于野毒株(P<0.01);双缺失株与野毒株感染小鼠后,载菌量在肝、脾中没有显著差异,在脑组织中双缺失株载菌量为10~4,高于野毒株的10~(3.07),差异极显著(P<0.01)。综上认为,LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因参与LM毒力因子的表达和脑组织的定植能力,与弱酸强碱条件下适应力及对RAW264.7细胞的黏附、侵袭和胞内增殖有关。本研究为LIPI-4的功能研究奠定了基础。

儿童产单核细胞李斯特菌脑膜炎2例并文献复习

目的:总结2例免疫功能正常儿童产单核细胞李斯特菌(Lm)脑膜炎的临床特点及抗生素治疗效果,提高对该疾病的认识。方法:回顾性分析2018年5月至2020年5月山东大学附属威海市立医院儿科收治的2例免疫功能正常的儿童产单核细胞李斯特菌脑膜炎的临床特点及治疗经过,并进行相关文献复习,对比分析国内儿童Lm脑膜炎病例报道中误诊情况、抗生素使用及相关并发症情况。结果:患儿均有发热、胃肠道等症状,脑脊液检查为典型化脓性脑膜炎表现,误诊及漏诊患儿有11例,7例患儿出现并发症;治疗上对头孢类药物不敏感,青霉素类仍作为首选药,美罗培南、万古霉素、利奈唑胺亦可作为临床选择用药。结论:对于有胃肠道症状的脑膜炎患儿,经验性抗生素治疗无效时,需警惕Lm脑膜炎,减少误诊及漏诊率,及时开始能覆盖李斯特菌的抗生素治疗,降低死亡率。

脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响

本文旨在构建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,探讨ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌致病力的影响。本研究利用同源重组技术构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,通过生物学特性试验探究ltaS基因缺失株对产单核细胞李氏杆菌生长能力和菌体形态的影响,Western blot试验探究亲本株EGDe-prfA、缺失株ΔltaS对InlA和InlB在细菌表面的锚定情况;使用鸡胚成纤维DF-1细胞进行细胞黏附侵袭试验、小鼠RAW264.7细胞进行吞噬试验与巨噬细胞内增殖试验测定ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌侵染能力的影响;小鼠脏器细菌载量和小鼠存活试验评估ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响。结果显示:利用同源重组技术成功构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,生长曲线试验和光学显微镜观察发现ltaS基因不影响产单核细胞李氏杆菌在BHI中正常生长和细菌形态,通过Western blot试验验证ltaS基因缺失导致细菌表面毒力的InlA和InlB锚定量降低。细胞黏附侵袭试验结果表明,ΔltaS对DF-1的黏附率极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01)并且侵袭率也极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01);吞噬试验结果显示,小鼠巨噬细胞RAW264.7对ΔltaS的吞噬率与亲本株EGDe-prfA相比无显著性差异(P>0.05);而在增殖试验中,ΔltaS在RAW264.7中增殖量与亲本株EGDe-prfA存在显著差异(P<0.05)。小鼠致病力试验结果显示,经ΔltaS感染的小鼠的肝、脾内细菌载量均显著低于EGDe-prfA(P<0.01)并且EGDe-prfA感染后的小鼠96 h内全部死亡,而缺失株ΔltaS感染的小鼠存活率为80%,测定出亲本株EGDe-prfA半数致死量LD 50为1.7×104 CFU,缺失株ΔltaS半数致死量LD 50为7.49×106 CFU。综上所述,ltaS基因缺失显著减少表面InlA和InlB的锚定量,减弱产单核细胞李氏杆菌对DF-1细胞的黏附侵袭能力与RAW264.7内细菌增殖能力,并且降低对小鼠的致病性。

新生儿感染产单核细胞李斯特菌的临床特征分析

目的分析新生儿感染产单核细胞李斯特菌(LM)的临床特征,增加国内新生儿感染LM的相关数据,以利于临床诊疗。方法回顾性分析该院在2016年6月至2023年5月感染LM新生儿的临床资料,包括患儿的性别、胎龄、体质量、Apgar评分等基本临床资料,患儿和患儿母亲的临床症状、实验室指标和抗菌药物使用情况,统计分析其相关临床特征及危险因素。结果研究共纳入23例感染LM的新生儿,其中4例为咽部感染,19例为无菌部位(血+脑脊液)感染。其中82.61%(19/23)的患儿有白细胞计数升高,91.30%(21/23)的患儿有C反应蛋白升高,30.43%(7/23)的患儿有降钙素原增高。患儿首发症状为呼吸急促(5例),呼吸困难(9例),无自主呼吸(6例),其他情况包括发热(7例),脑膜炎(12例),电解质紊乱(15例)等。在新生儿母亲中,13.04%(3/23)有生冷食物进食史,52.17%(12/23)存在发热(37.3~39.7℃),13.04%(3/23)腹泻,17.39%(4/23)腹痛,60.87%(14/23)存在产前感染的情况。新生儿病死率为21.74%(5/23),不良结局发生率为56.52%(13/23)。通过综合分析,比较存活患儿组和不良结局患儿组(死亡+放弃)的相关特征,结果显示仅Apgar评分(P=0.009)为预后的危险因素。结论临床需高度警惕孕妇感染症状和饮食史,一旦怀疑应立即进行细菌检测和预防性用药,并使用足够疗程的抗菌药物,避免不良结局的发生。

产单核细胞李斯特菌分子分型技术的最新研究进展

随着科学技术的发展与成熟,分子分型技术备受关注,其中,脉冲场凝胶电泳及全基因组测序已成为多种细菌分型的金标准,而基于电泳的分子分型技术、多位点序列分型、多毒力位点序列分型、分子血清分型也各有优缺点和适用范围。该文拟对产单核细胞李斯特菌分子分型技术进行详细阐述,旨在为临床李斯特菌病的暴发流行、同源性分析提供研究方法,为食源性疾病的监测、预警、风险评估及溯源提供参考依据。

1例卵巢恶性肿瘤患者产单核细胞李斯特菌血流感染分析

单核细胞增生李斯特菌(以下简称“单增李斯特菌”)是一种短小的革兰阳性无芽孢杆菌,在自然界分布比较广泛,常见于土壤、河流、植物、屠宰场等废弃物及动物源性食品(肉、乳及乳制品、海产品等)中。单增李斯特菌是人畜共患食源性致病菌,在老年人、孕妇、免疫功能低下人群中可引起严重症状(如脑膜炎、败血症、流产等)[1]。目前国际上公认李斯特菌7个菌种,仅单增李斯特菌可引起人类感染,属于细胞内寄生的革兰阳性杆菌,主要引起败血症、孕妇流产、热性胃肠炎和脑膜炎等,临床病死率较高。

产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程。[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价。[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失。突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约103倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击。实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力。[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

利用PCR技术从血清型1／2a的产单核细胞李斯特菌Lm-4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA，转入E．coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa。以纯化蛋白为材料进行了AetA单抗的研制，获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1：5×10^4-1：1×10^5。选取单抗1A5进行Western blot分析，结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异性反应，且与Lm-4多抗血清的Western blot结果一致。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础。

产单核细胞李斯特菌溶血素的纯化

本文旨在探讨产单核细胞李斯特菌溶血素(LLO)的纯化方法。将产单核细胞李斯特菌(LM)接种于BHI液体培养基中培养,得到含LLO的培养液上清(LLO1),再经70%饱和硫酸铵沉淀、透析,得到溶血素粗提物(LLO2),LLO2经凝胶过滤层析,聚乙二醇浓缩,得到活性峰收集液(LLO3)。通过以上三步的纯化,溶血素的比活提高160倍,纯化蛋白在SDS-PAGE中呈现一条带,达电泳级纯度。

沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法,提高检测效率和敏感性。方法选择沙门菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因序列设计引物,在单一PCR方法基础上,建立检测两种病原菌的多重PCR技术。结果在495bp和850bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出32pg的沙门菌DNA和274pg的李斯特菌DNA,样品检测表明该方法与单一PCR和国标方法的符合率达100%。结论本研究建立了能同时检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌的多重PCR技术,为主要食源性病原菌快速检测提供了新方法。

产单核细胞增生性李斯特氏菌致病机制的研究进展

产单核细胞增生性李斯特氏菌是一类人畜共患的食源性致病菌。本文阐述了产单核细胞增生性李斯特氏菌的生物学特性、毒力因子及流行病学,旨在为产单核细胞增生性李斯特氏菌的致病机制提供理论依据。

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌(LM)yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素(LLO)抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。

产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达

利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特菌(LM)的溶血素基因hlyA,获得一条大小约为1600bp的目的片段,将其与pMD18-T载体连接,经酶切、PCR鉴定,命名为pMD18-T-hlyA。测序结果显示所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列同源性为99%。利用含有BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点引物B从pMD18-T-hlyA扩增不含信号肽序列的目的片段B,获得了大小约为1500bp的基因片段,该片段与pET32a表达载体经BamHⅠ/XhoⅠ处理后进行连接,转化BL21受菌体。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后获得阳性pET32a-hlyA表达重组质粒,将重组菌用终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达,结果表明重组菌在诱导2h～3h表达量最高,融合蛋白约占菌体的40%,分子量大小约为80ku;利用LM的阳性血清进行Western blot分析,证实该融合蛋白可以被LM阳性血清所识别,为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ELISA诊断方法提供了条件。

产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究

目的 建立产单核细胞李斯特菌的分子检测方法及其亚分型体系。方法 对LM菌株进行hly基因的PCR检测 ,并扩增其中 10株PCR检测阳性菌株的actA基因 3’末端的 82 7bp的DNA片段 ,对扩增的片段进行测序。利用遗传进化树分析软件分析。结果 2 4株LM的hly基因扩增均出现 85 0bp左右特异性片段 ,而非LM株未出现该特异性片段。所建立的分子亚分型方法将 10株LM归为两个遗传谱系。结论 新建立的PCR法检测LM具有较高的灵敏性与特异性 ,LM分子亚分型体系的建立为进一步研究不同LM分离株的群体遗传学、流行病学及生态学奠定了技术基础。

产单核细胞李斯特菌溶血素O基因在大肠杆菌中的优化表达及ELISA检测方法的建立

在克隆产单核细胞李斯特菌(LMO)hlyA基因并构建其原核表达载体的基础上,进一步对IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等影响目的蛋白表达的重要条件进行了优化。根据确定的最佳诱导条件,使目的蛋白获得了高效表达。对表达的李斯特菌溶血素O(LLO)进行了纯化,以其作为靶抗原,采用间接ELISA方法检测了动物血清中的特异性LLO抗体。结果表明,用表达产物作为靶抗原可对LMO感染动物进行初步诊断,为建立基于LLO的动物李斯特菌病血清学诊断技术奠定了基础。

产单核细胞李斯特菌脑膜脑炎1例

1资料 患者男，36岁，以发热、头痛、意识模糊5d为主诉于2008年9月1日收住我院。患者5d前觉鼻塞，双颞部剧烈头痛，未予重视，随后又出现发热，体温最高达41℃，无寒战、恶心、呕吐，无四肢抽搐。入院查体：体温38．3℃，呼吸21次／min，

结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6基因重组产单核细胞李斯特菌的构建

对编码结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的基因片段进行了扩增,并将其克隆入穿梭载体pKSV7,利用基因同源重组技术构建了表达结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的重组产单核细胞李斯特菌(LM)。结果表明,外源基因成功整合入LM基因组并获得转录;Western-blot分析结果显示,重组菌携带的外源基因在动物体内能够表达;溶血试验与细胞感染试验表明,较之野生型李斯特菌,外源基因的插入破坏了重组菌LM(pKSV7-H85-6B)的溶血活性,显著降低了对细胞的侵袭能力。证实,携带结核分枝杆菌保护性抗原Ag85B和ESAT-6的重组李斯特菌对结核病新型疫苗的研究具有潜在应用价值。

2015-2017年江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌污染情况调查及分子分型研究

目的了解2015-2017年江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌的污染及分子分型情况。方法采集全省选定的24个市县的超市、百货商场等市场流通环节销售的12类食品(包括肉类、豆制品、速冻米面制品等)样品,采用国家食品污染和有害因素风险监测工作手册方法检测和鉴定产单核细胞李斯特菌。对三年来收集的阳性菌株采用脉冲场凝胶电泳方法(PFGE)进行分子分型。结果三年共采集4816份样品,产单核细胞李斯特菌总检出率为1.43%,2015年污染率较高为2.21%。12类食品中肉与肉制品的检出率较高,2015年为3.58%,2016年为1.57%,2017年2.12%。不同地区采集的样品阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=45.44,P=0.004),各大类食品间的检出率比较差异有统计学意义(χ2=33.98,P<0.001),而不同流通环节抽取的样品比较差异无统计学意义(χ2=7.84,P=0.55)。部分菌株PFGE结果显示型别较多,仅有三株菌PFGE型别为100%一致。结论江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌的污染情况稳中向好,但仍有一定的安全隐患,相关监管部门应加强重视,预防食源性疾病的发生。

检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用

产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后,制备单克隆抗体,测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性、重复性、稳定性及模拟样品进行检测,并初步应用于实际海产品的检测。结果发现,制备的LLO单克隆抗体特异性强、稳定性高、重复性佳、灵敏度较高,亲和力好,亲和力常数为4.25×10^(8) L·mol^(-1)。人工污染样品试验表明灵敏度与纯细菌培养物基本一致,为3.0×10^(5)CFU·mL^(-1)。将LLO胶体金试纸条应用于500份海产品的实际检测中,产单核细胞李氏杆菌的阳性检出率为2.20%(11/500),略低于国标检测方法(GB4789.30—2010)的2.40%(12/500)和PCR检测方法的2.40%(12/500),三者之间符合率为91.67%。另外缩短检测时间至15 min,检测效率大幅度提高。本研究建立的LLO胶体金检测方法可用于产单核细胞李氏杆菌的快速检测。