产志贺毒素大肠埃希氏菌活菌检测方法的应用现状及展望

产志贺毒素大肠埃希氏菌作为一种重要的食源性致病菌,会对人体健康造成严重威胁。对其进行快速、准确的鉴定检测是预防和控制相关疾病的有效手段。基于此,文章对目前可用于检测活体产志贺毒素大肠埃希氏菌的方法进行综述,主要包括传统的细胞培养方法、免疫学检测方法和分子生物学方法等,并对这些方法的应用和发展前景展开了深入探讨。随着分子生物学和生物工程技术的发展,不同检测方法联合使用可以克服单一方法的缺陷,从而取得更高效、准确的检测结果。

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

于2018年9月—2019年3月,每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本,共抽取140个牛肉及制品样本,在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%,eae的阳性率为52.2%。每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%;eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份,样本阳性菌株检出率为2.9%;检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份,样本阳性菌株检出率为8.6%。

不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)可分泌志贺毒素,致病性强,建立简便快速的STEC检测方法对控制食源性疾病的发生和蔓延极为重要。使用生物素标记STEC的标志性毒力基因stx1与stx2的下游引物进行不对称聚合酶链式反应,获得生物素化的目标单链DNA与聚苯乙烯微球标记的目标基因的上游引物特异性结合形成结合物,结合物上的生物素因与试纸条检测线上链霉亲和素结合而使检测线显色。通过建立的方法可成功快速检测出携带不同毒力基因的STEC,同时利用该方法对23株菌株进行stx基因的检测,结果显示该方法可准确检测到含有STEC标志性毒力基因stx的菌株,且表现出良好的特异性。

新疆牛源和人源产志贺毒素大肠埃希氏菌毒力岛的分布

为了解新疆牛源和人源产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)毒力岛(pathogenicity islands, PAIs)的分布情况,采用PCR方法对139株牛源和3株人源非O157 STEC进行PAIs OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD)、OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2)、OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2)及OI-122(ent/espL2、nleB、nleE、Z4321、Z4326、Z4332和Z4333)检测。结果显示,牛源和人源STEC均不同程度携带这些PAIs基因,其中nleG9(OI-71)检出率最高,为63%;Z4321和Z4326(OI-122)次之,分别为33%和36%;nleC(OI-36)检出率最低,为14%。毒力谱分析显示,OI-36中nleD+nleH1-1组合最多,占40%;OI-57中nleG2-3+nleG5-2组合最多,占43%。nleG9和Z4321分别在OI-71和OI-122中最常见,占83%和43%。模块化分析显示,83株STEC(58%)携带不完整的OI-122,59株(42%)未携带OI-122。牛源和人源STEC分布的PAIs不同,且PAIs与eae~+菌株关系密切。与牛源STEC相比,人源STEC携带的PAIs基因更丰富,但部分牛源STEC同样携带多种PAIs基因潜在感染风险。

可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立可视化环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)。方法以stx1/2基因作为检测靶基因,利用羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)指示剂,建立一种可视化检测STEC的LAMP方法。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测。结果建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察(紫罗兰色到天蓝色)判定结果。该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌。Stx1-LAMP和stx2-LAMP的检出限分别为3.54×10^(‒4)和3.54×10^(‒5) ng/µL,而常规PCR中stx1和stx2的检出限分别为3.54×10^(‒3)和3.54×10^(‒2) ng/µL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍。对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为10^(3)和10^(2) CFU/mL的加标样品。结论本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP检测方法。

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的评价基于免疫磁分离(immunomagnetic separation,IMS)的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)快速检测方法的灵敏度与特异性。方法将大肠埃希氏菌O157:H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液和25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果本方法检测大肠埃希氏菌O157:H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10^(2)CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10^(3) CFU/mL。8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株非目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论该方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中7种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。

LAMP实时浊度法快速检测食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌

针对产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC) stx1和stx2基因的特异性序列分别设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,利用实时浊度仪建立食品中STEC的LAMP实时浊度法快速检测方法。LAMP反应在实时浊度仪63℃恒温下1 h可完成。对方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价,并在实际样品检测中进行应用。经优化该方法的检测灵敏度可达150拷贝/反应,4株STEC菌株LAMP扩增结果与其基因型一致,其他21株非STEC菌株均未出现非特异性扩增。395份食品样品检出STEC阳性68份(阳性率为17.2%),所检食品类别中畜产品阳性率最高(达31.3%),禽产品、水产品和可生食蔬菜均有少量阳性样品检出,阳性样品中以stx2基因阳性型为主。结果表明,LAMP实时浊度法具有快速、灵敏、特异性强、操作简便的优势,适用于食品中STEC的快速筛查。

肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因比较

目的比较肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌（Ｅｎｔｅｒｏ－ＳＬＴｓ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｄＩｎｖａｓｉｖｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ－ｉ，ＥＳＩＥＣ）和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因，阐明它们之间的异同。方法使用质粒酶切图谱分析，侵袭性基因ｉｐａＢ、ｉ－ｐａＣ、ｉｐａＤ的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交实验，以及利用ＥＩＥＣ８４０１菌株的侵袭性大质粒酶切产物作为探针与ＥＳＩＥＣ大质粒进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交等方法。结果发现ＥＳＩＥＣ菌株不具有ＥＩＥＣ、志贺氏菌所特有的ｉｐａＢ、ｉｐａＣ、ｉｐａＤ基因；ＥＳＩＥＣ菌株质粒与ＥＩＥＣ、志贺氏菌质粒同源性很小。结论ＥＳＩＥＣ菌株编码侵袭力的基因与ＥＩＥＣ及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，证明对ＥＳＩＥＣ的分类是正确的。

朱鹮源大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏检测

为初步了解朱鹮肠道正常菌群的组成,并对其可能发生的疾病进行用药监测及预防,对采集自成年健康朱鹮的11份肛拭子进行了大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性检测。结果显示,从11只朱鹮肛拭子中分离到9株大肠埃希氏菌、7株肺炎克雷伯氏菌和4株A型产气荚膜梭菌,分离率分别为81.8%、63.6%和36.4%。药敏试验显示,大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌对磺胺异噁唑、青霉素、氨苄西林、四环素和多西环素等药物的耐药性较强,产气荚膜梭菌仅对磺胺类药物表现出较强耐药性。初步鉴定朱鹮的肠道正常菌群中存在大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和产气荚膜梭菌,并检测分析了各菌株的耐药规律,为进一步研究朱鹮肠道正常菌群结构和防控朱鹮消化道疾病提供了参考依据。

抗猪产肠毒素大肠埃希氏菌卵黄抗体的研制及攻毒治疗试验

利用产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)标准菌株K88,K99,987P制备灭活苗,免疫待开产母鸡,应用琼脂扩散试验检测母鸡血清抗体和卵黄抗体(IgY)效价,在琼扩效价≥1∶64时收集卵黄,卵黄经氯仿去脂、硫酸胺沉淀后提纯出卵黄抗体,将提纯卵黄抗体对攻毒仔猪口服治疗,结果显示治疗仔猪腹泻状况明显减轻,与对照组相比有显著差异;治疗组未出现死亡而对照组仔猪有33%～67%的死亡率。试验结果表明,研制的IgY对ETEC所致的仔猪腹泻具有明显的效果。

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx_1和stx_2基因

目的建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。方法根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×102copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×103CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。

新疆部分地区牛羊源产志贺毒素大肠埃希菌菌株检测与分析

产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是一类携带了前噬菌体编码的一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌,已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。为了解新疆部分地区牛、羊源各个环节产志贺毒素大肠埃希菌的感染情况及其遗传多样性,以及分离株对17种常见抗生素的敏感性,笔者采用PCR方法对STEC分离株进行了4种毒力基因(stx1、stx2、eae、hlyA)的检测和ERIC-PCR基因分型研究。结果表明:从屠宰场、养殖场和市场共431份样品中分离出产志贺毒素的大肠埃希菌64株,其中,编码stx1+stx2的STEC有31株(48.4%),只编码stx1的STEC有29株(45.3%),只编码stx2的STEC有4株(6.3%),4种毒力基因同时存在的有1株。药物敏感性检测发现STEC菌株对麦迪霉素(61%)、头孢噻吩(4.7%)、头孢西丁(4.7%)、氨苄西林(3.1%)、哌拉西林(1.6%)、妥布霉素(1.6%)、头孢唑啉(1.6%)等7种抗生素存在耐药。ERIC-PCR检测结果呈多态性分布,分为A(36株)和B(28株)两个簇。STEC菌株在新疆部分地区牛、羊源各个环节被检出,其中一些菌株可能会增加对食物的污染,从而引起人发病。

藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定

为研究外观健康藏系绵羊携带沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌情况,对采自外观健康藏系绵羊的19份肛门拭子进行大肠埃希菌和沙门菌分离鉴定。用选择性培养基及普通PCR方法共分离鉴定出1株沙门菌和13株大肠埃希菌,其中产志贺毒素大肠埃希菌4株,3株含有产志贺毒素基因Stx 1,1株含有产志贺毒素基因Stx 2,沙门菌invA基因和产志贺毒素大肠埃希菌Stx基因同源性分析表明,分离株沙门菌的invA与NCBI上已登录的5种血清型沙门菌核苷酸序列同源性为99.8%,4株产志贺毒素大肠埃希菌与NCBI上已登录菌株的核苷酸序列同源性都大于95%。本研究结果为高原地区藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的流行病学调查奠定了基础。

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性。方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-tim ePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性。血清型为O157:H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%。结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关。STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。

2007年浙江省衢州地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染状况

目的：了解2007年浙江省衢州地区产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7在动物中的分布情况及其耐药性、PFGE分型及毒力基因携带状况。方法：按全国O157：H7监测方案于5～10月份肠道传染病高发季节，在衢州地区采集各种动物粪便／肛拭，用免疫磁珠富集后进行O157：H7分离培养、鉴定，可疑菌株以PCR法检测O、H抗原及志贺样毒素（SLT1和SLT2）、粘附抹平因子（eaeA）及溶血素（hly）4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）方法进行同源性分析，同时选择14种抗生素进行药敏试验，分析分离所得菌株的耐药状况。结果：共监测动物粪便标本300份，分离得产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7菌株16株，分离率为5．33％。16株O157：H7菌株，毒力基因Hly、eaeA、SLT2均阳性，SLT1均阴性。脉冲场凝胶电泳分型显示，16株O157：H7菌株可分2个PFGE基因型，型间差异较小。耐药性分析显示这些菌株对红霉素、利福平的耐药率最高，达100．0％，对其他受试抗生素均敏感。结论：该地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7带菌率较高，所分离菌株主要携带SLT2基因，因此推测该地区存在发生产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7感染暴发或流行的潜在危险，需增加对动物源性O157：H7的监测力度。

产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

简述了产肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)K88-K99、K88ac-LTB、K99-F41和ST-LT双价基因工程疫苗的研制方法、生产工艺、免疫效果及生态效应及其研究进展,同时阐明了用这些疫苗免疫妊娠母畜,可使吸吮了母畜初乳的幼畜的腹泻发病率和死亡率显著下降,且不会带来生态环境污染。认为这些基因工程疫苗仍有不足之处,需要进一步加以改进。

新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分子生物学研究进展

阐述了新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)菌毛的结构、分子生物学特性、基因检测技术、菌毛抗原受体的生化特性以及菌毛载体系统的优点;另外,从分子结构与功能、作用机理、基因检测三方面叙述了新生仔猪ETEC不耐热肠毒素和耐热肠毒素的研究进展。

产志贺样毒素大肠埃希菌Ⅰ类整合子的鉴定和分析

目的阐明各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)中Ⅰ类耐药整合子的分布、特征、所含基因盒的状况以及所表达的耐药信息。方法常规分离出大肠埃希菌、血清学分型,PCR法鉴定产stx1-2毒素性菌株;纸片扩散法对17种抗菌药物进行耐药性监测和分析;PCR法鉴定Ⅰ类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果各种标本中共鉴定出46株产志贺样毒素大肠埃希菌,其中23株为O157∶H7;全部STEC对复方新诺明耐药,对链霉素耐药率为28.3%,氨苄西林为30.4%,而且有5株对至少>4种抗菌药物多重耐药,耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林-庆大霉素;46株分离株中有11株(23.9%)鉴定出Ⅰ类整合子,PCR产物测序得知9株携带aadA1基因盒,2株携带aadA2基因盒,均来自氨基糖苷类抗菌药物耐药菌株(39.3%),传递对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。结论Ⅰ类整合子存在于各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌中,并携带相应的基因盒,决定着对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。

不同来源产志贺毒素大肠埃希菌分布特征

目的探讨不同标本中产志贺样毒素大肠埃希菌(STEC)的分布特征。方法采集动物粪便、肉类食品和排污口污泥样品,常规分离大肠埃希菌,血清学分型,PCR鉴定产志贺样毒素(stxl,stx2)菌株。结果293份标本中鉴定出8株STEC,1株为产志贺毒素O157:H7型,2株为不产志贺毒素O157:H7型,5株为产志贺毒素非O157:H7型。结论STEC存在于不同来源的标本中,菌株表型与毒力因子存在一定差异。

定量产肠毒素性大肠埃希氏菌F_(41)黏附素反向间接血凝试验的建立

利用 F41 单因子血清 IgG 致敏绵羊红细胞,建立了定量产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)F41黏附素的反向间接血凝试验。经致敏的绵羊红细胞能被F41单因子血清特异性地抑制,且不与 ETEC K88、ETEC K99、ETEC 987P、致仔猪水肿病大肠埃希氏菌 O138、鼠伤寒沙门菌和猪链球菌2型菌液出现交叉反应,其敏感性比甘露糖抵抗血凝反应(MRHA)至少高 25 倍。结果表明,该反向间接血凝试验具有很高的特异性和敏感性,可用于生物制品中黏附素含量的定量。