一组由产志贺毒素大肠埃希菌O26:H11菌株引起的溶血性尿毒综合征

溶血性尿毒综合征(HUS)是引起儿童急性肾功能衰竭的常见原因。由产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7菌株引起的感染和HUS的流行病学和临床特点已经被研究得很透彻,STEC O111:H菌株感染也时见报道。

产志贺毒素大肠埃希氏菌活菌检测方法的应用现状及展望

产志贺毒素大肠埃希氏菌作为一种重要的食源性致病菌,会对人体健康造成严重威胁。对其进行快速、准确的鉴定检测是预防和控制相关疾病的有效手段。基于此,文章对目前可用于检测活体产志贺毒素大肠埃希氏菌的方法进行综述,主要包括传统的细胞培养方法、免疫学检测方法和分子生物学方法等,并对这些方法的应用和发展前景展开了深入探讨。随着分子生物学和生物工程技术的发展,不同检测方法联合使用可以克服单一方法的缺陷,从而取得更高效、准确的检测结果。

多重实时聚合酶链式反应法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立多重实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichiacoli,STEC)的方法。方法以产志贺毒素大肠埃希氏菌携带的毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae靶基因引物探针建立多重实时PCR体系,并采用原位冻干技术将PCR反应体系和阳性质控品进行了预先分装冻干,制成稳定、便捷的即用型反应体系,随后对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果所建立的多重实时PCR法检测eae、stx1、stx2基因的灵敏性为102 CFU/mL。与32种非STEC菌均无交叉反应。整体检测时长可控制在1 h以内,冻干体系可在常温条件下保存1年以上。结论本方法快速、简便,适用于测定食品中的STEC。

免疫磁珠富集联合荧光定量PCR快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌O26∶H11

目的建立肉制品中免疫磁珠富集(IMS)联合实时荧光定量PCR(qPCR)技术快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O26∶H11的方法。方法建立针对编码O26抗原wzx基因实时荧光定量PCR方法,并验证其特异性和敏感性;人工污染不同浓度STEC O26∶H11的牛肉馅样品,在增菌不同时间后,将增菌液原液、增菌液经免疫磁珠特异性捕获分离物分别进行qPCR检测及平板分离。结果 qPCR检测O26∶H11可产生特异性荧光信号,而23株其他血清型的大肠埃希菌及7株其他种属细菌均未见荧光信号;本方法对纯培养的检测限为5×102cfu/ml。人工染菌试验中,当初始染菌浓度达到或高于3×102cfu/25 g时,增菌培养6 h后IMS捕获物可以检测到荧光信号。培养20 h后,初始染菌浓度为3"10-1cfu/25 g以上,对增菌液直接检测和IMS捕获物检测都可以检测到荧光信号。初始污染浓度较低时,增菌6 h后IMS-qPCR的检测灵敏度高于增菌液直接qPCR检测;IMS捕获物涂布显色培养基分离目标菌检测灵敏度高于增菌液直接涂布;CHROMagar STEC显色培养基分离STEC O26∶H11的检测灵敏度高于山梨醇麦康凯培养基(SMAC)。结论 IMS联合qPCR检测食品中的STEC O26∶H11具有特异性强、敏感度高、快速、易操作等特点,可以提高样品中STEC O26∶H11菌的检出率,适用于牛肉制品中STEC O26∶H11的快速检测。

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性。方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-tim ePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性。血清型为O157:H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%。结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关。STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。

2007年浙江省衢州地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染状况

目的：了解2007年浙江省衢州地区产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7在动物中的分布情况及其耐药性、PFGE分型及毒力基因携带状况。方法：按全国O157：H7监测方案于5～10月份肠道传染病高发季节，在衢州地区采集各种动物粪便／肛拭，用免疫磁珠富集后进行O157：H7分离培养、鉴定，可疑菌株以PCR法检测O、H抗原及志贺样毒素（SLT1和SLT2）、粘附抹平因子（eaeA）及溶血素（hly）4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）方法进行同源性分析，同时选择14种抗生素进行药敏试验，分析分离所得菌株的耐药状况。结果：共监测动物粪便标本300份，分离得产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7菌株16株，分离率为5．33％。16株O157：H7菌株，毒力基因Hly、eaeA、SLT2均阳性，SLT1均阴性。脉冲场凝胶电泳分型显示，16株O157：H7菌株可分2个PFGE基因型，型间差异较小。耐药性分析显示这些菌株对红霉素、利福平的耐药率最高，达100．0％，对其他受试抗生素均敏感。结论：该地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7带菌率较高，所分离菌株主要携带SLT2基因，因此推测该地区存在发生产志贺毒素大肠埃希菌O157：H7感染暴发或流行的潜在危险，需增加对动物源性O157：H7的监测力度。

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

于2018年9月—2019年3月,每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本,共抽取140个牛肉及制品样本,在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%,eae的阳性率为52.2%。每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%;eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份,样本阳性菌株检出率为2.9%;检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份,样本阳性菌株检出率为8.6%。

非O157产志贺毒素大肠埃希菌研究进展

产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类能产生一种或一种以上志贺毒素的大肠埃希菌的总称,包括400余种血清型,其中以O157∶H7血清型为主。近年来,非O157STEC在世界范围内引起散发感染和暴发的报道明显增加,但由于非O157STEC血清型多样,菌株间表型差异较大,目前尚无一种有效的能用于所有非O157STEC菌株分离的方法,因此非O157STEC的流行情况可能被低估。本文就非O157STEC的病原学、致病机制、流行病学特征、实验室诊断、治疗和预防等方面的研究进展做一简要综述。

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx_1和stx_2基因

目的建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。方法根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×102copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×103CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。

新疆部分地区牛羊源产志贺毒素大肠埃希菌菌株检测与分析

产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是一类携带了前噬菌体编码的一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌,已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。为了解新疆部分地区牛、羊源各个环节产志贺毒素大肠埃希菌的感染情况及其遗传多样性,以及分离株对17种常见抗生素的敏感性,笔者采用PCR方法对STEC分离株进行了4种毒力基因(stx1、stx2、eae、hlyA)的检测和ERIC-PCR基因分型研究。结果表明:从屠宰场、养殖场和市场共431份样品中分离出产志贺毒素的大肠埃希菌64株,其中,编码stx1+stx2的STEC有31株(48.4%),只编码stx1的STEC有29株(45.3%),只编码stx2的STEC有4株(6.3%),4种毒力基因同时存在的有1株。药物敏感性检测发现STEC菌株对麦迪霉素(61%)、头孢噻吩(4.7%)、头孢西丁(4.7%)、氨苄西林(3.1%)、哌拉西林(1.6%)、妥布霉素(1.6%)、头孢唑啉(1.6%)等7种抗生素存在耐药。ERIC-PCR检测结果呈多态性分布,分为A(36株)和B(28株)两个簇。STEC菌株在新疆部分地区牛、羊源各个环节被检出,其中一些菌株可能会增加对食物的污染,从而引起人发病。

藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定

为研究外观健康藏系绵羊携带沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌情况,对采自外观健康藏系绵羊的19份肛门拭子进行大肠埃希菌和沙门菌分离鉴定。用选择性培养基及普通PCR方法共分离鉴定出1株沙门菌和13株大肠埃希菌,其中产志贺毒素大肠埃希菌4株,3株含有产志贺毒素基因Stx 1,1株含有产志贺毒素基因Stx 2,沙门菌invA基因和产志贺毒素大肠埃希菌Stx基因同源性分析表明,分离株沙门菌的invA与NCBI上已登录的5种血清型沙门菌核苷酸序列同源性为99.8%,4株产志贺毒素大肠埃希菌与NCBI上已登录菌株的核苷酸序列同源性都大于95%。本研究结果为高原地区藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的流行病学调查奠定了基础。

产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

目的探讨产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)类型及耐药机制。方法采用纸片琼脂扩散法筛选36株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs菌株,接合传递实验、质粒谱分析、PCR检测耐药基因和DNA序列分析产ESBLs菌株的表型和基因型。结果双纸片扩散法证明有2株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs,美国株E.coli 5nonO157:H7和中国株E.coli 27 O157:H7对头孢他啶等第三、第四代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素耐药,并能通过5.8kb的质粒传递给受体菌。PCR检测含有blaTEM基因。DNA同源分析表明861bp的blaTEMDNA片段与blaTEM-IDNA片段同源。结论产志贺毒素大肠埃希菌美国株和中国株产生相同类型的ESBLs,表现出对第三、第四代β-内酰胺酶类抗生素耐药。

山东省首次检出O_(157)大肠埃希菌志贺毒素Ⅱ变种

目的:了解山东省E.coliO157大肠埃希菌携带Stx2及Stx2vha情况。方法:采用从山东省5个监测点腹泻病人和家禽、家畜等粪便标本中分离的O157大肠埃希菌,用PCR方法检测特异性志贺毒素2及其变种毒素;提取菌株的染色体DNA进行限制性内切酶PstI消化,使用slt2探针进行Southern杂交检测菌株毒素的变化情况。结果:从腹泻病人、家禽家畜等粪便标本分离的O157大肠埃希菌PCR检测STL2(c,d)阳性的9株,用slt2探针杂交方法检测有4株为Stx2vha阳性,其中1株杂交带型不同于其他菌株,是否为新的毒素变种需进一步研究。结论:山东省从腹泻病人和外环境分离的O157大肠埃希菌存在志贺毒素Ⅱ变种。

产志贺毒素肠聚集性大肠埃希菌感染的检验诊断与防治

2011年5月起，德国出现新型肠出血性大肠埃希菌（en—terohhaemorrhagicEscherichiacoli，EHEC）感染的疫情，来势凶猛．很快蔓延到英国、荷兰、法国、奥地利、挪威、西班牙、瑞士、丹麦、芬兰、捷克等几乎整个欧洲国家，美国也发现了确诊病例。截止6月底，已报告有3600余人发病，死亡52人。更为严重的是，有852例感染者（约20％）发生了溶血性尿毒综合征（haemolyticuremicsyndrome，HUS）。患者在腹泻、发热后很快出现急进性的肾功能衰竭、血小板减少和血管内溶血等症状而危及生命阁。因此，及时的诊断和进行抢救性治疗成为关键。

不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)可分泌志贺毒素,致病性强,建立简便快速的STEC检测方法对控制食源性疾病的发生和蔓延极为重要。使用生物素标记STEC的标志性毒力基因stx1与stx2的下游引物进行不对称聚合酶链式反应,获得生物素化的目标单链DNA与聚苯乙烯微球标记的目标基因的上游引物特异性结合形成结合物,结合物上的生物素因与试纸条检测线上链霉亲和素结合而使检测线显色。通过建立的方法可成功快速检测出携带不同毒力基因的STEC,同时利用该方法对23株菌株进行stx基因的检测,结果显示该方法可准确检测到含有STEC标志性毒力基因stx的菌株,且表现出良好的特异性。

从食品从业人员中分离到产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌

自一食品从业人员粪便标本中，分离到１株ＥＳＩＥＣ，该菌生化反应符合大肠杆菌特性，ＩＭＶＣ反应＋＋－－，与Ｉｎｖ及ＳＬ３２ＤＮＡ探针杂交，对ＨＥｐ－２细胞呈集聚状粘附。符合ＥＳＩＥＣ的典型特征。该菌株对昆明小鼠有较强的致病性。在所检测到的２０余种抗生素中，仅对复达欣、丁按卡那、呋喃妥因敏感，为多重耐药株。

非致病性大肠埃希菌能增多大肠埃希菌O157：H7志贺毒素的产生

大肠埃希菌(简称大肠杆菌)O157：H7毒力因子为志贺毒素2(stx2)，其基因由温和噬菌体编码，由晚期基因启动子调控表达。stx2的合成与释放需要诱导噬菌体溶菌周期，而且正常肠道大肠杆菌感染了毒素编码的噬菌体就能制造毒素和噬菌体，使毒素水平远远超过病原性菌株本身的产量，作者在体外以及鼠肠道验证了这一假设。

产志贺毒素大肠埃希菌的特殊类型

产志贺毒素大肠埃希菌 (STEC)的菌种以O15 7∶H7为代表 ,但现在已扩展至近 70个血清型。STEC的重要生化反应特征是不发酵山梨醇 ,现已在德国、捷克发现能在 2 4h内发酵山梨醇的菌株 ,且其H抗原缺失。少数不产生志贺毒素、stx基因为阴性的发酵山梨醇的O15 7∶H菌株也在欧洲发现。以上新情况使STEC的检出更具挑战性。

重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物。以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛选适宜的RPA检测引物和探针序列,验证了19株STEC菌株(含9种stx基因亚型)和21株非STEC菌株,并采用人工污染的牛肉样品对集成化的微流控芯片进行评价。筛选出检测stx1和stx2基因的高特异性引物、探针组合,与美国农业部微生物实验室技术指南中STEC定量聚合酶链式反应(real-time polymerasechainreaction,real-timePCR)方法相比,目标基因检测的包容性和排他性均为100%。荧光RPA微流控芯片法在20 min内可同时进行32个反应,可检测STEC菌体灵敏度为9.5×10^(3)CFU/mL。根据GB 4789.6—2016《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》的规定经增菌培养后在人工污染牛肉样品中可检测1 CFU/25 g的STEC污染,方法的相对正确度和相对检出水平均为100%。本研究开发了一种荧光RPA微流控芯片检测方法,可检测常见stx基因亚型STEC菌株,操作简单、反应速度快,适用于STEC的高通量快速检测。

新疆牛源和人源产志贺毒素大肠埃希氏菌毒力岛的分布

为了解新疆牛源和人源产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)毒力岛(pathogenicity islands, PAIs)的分布情况,采用PCR方法对139株牛源和3株人源非O157 STEC进行PAIs OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD)、OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2)、OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2)及OI-122(ent/espL2、nleB、nleE、Z4321、Z4326、Z4332和Z4333)检测。结果显示,牛源和人源STEC均不同程度携带这些PAIs基因,其中nleG9(OI-71)检出率最高,为63%;Z4321和Z4326(OI-122)次之,分别为33%和36%;nleC(OI-36)检出率最低,为14%。毒力谱分析显示,OI-36中nleD+nleH1-1组合最多,占40%;OI-57中nleG2-3+nleG5-2组合最多,占43%。nleG9和Z4321分别在OI-71和OI-122中最常见,占83%和43%。模块化分析显示,83株STEC(58%)携带不完整的OI-122,59株(42%)未携带OI-122。牛源和人源STEC分布的PAIs不同,且PAIs与eae~+菌株关系密切。与牛源STEC相比,人源STEC携带的PAIs基因更丰富,但部分牛源STEC同样携带多种PAIs基因潜在感染风险。