产志贺毒素大肠杆菌在中国牦牛及其肉奶制品中的分布与遗传规律研究

产志贺毒素大肠杆菌是一种潜在危害食品安全和公共健康的致病菌。在中国的牦牛养殖业中存在潜在的食源污染风险。不同疫情报道、肠内菌群多样性研究以及地理和季节性变化的分析揭示了牦牛体内产志贺毒素大肠杆菌的分布情况。通过深入了解产志贺毒素大肠杆菌的风险,为制定更有效的食品安全措施提供了依据,以期为产志贺毒素大肠杆菌在中国牦牛及其肉奶制品中的分布与遗传规律的全面洞察,从而促进食品安全的改进和保护公众健康。

牛源罗伊氏乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠生长性能、免疫性能、抗氧化能力及肠道健康的影响

本试验旨在研究牛源罗伊氏乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)攻毒小鼠生长性能、脏器指数、免疫性能、抗氧化能力、肠道屏障功能及肠道组织形态结构的影响。试验选取4周龄、初始体重相近的无特定病原体(SPF)级ICR雄性小鼠40只,随机分为4组,即对照组、攻毒组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组10只。小鼠适应性饲养7 d后开始正式试验,正试期22 d。在正式试验第1~17天,对照组和攻毒组小鼠饲喂基础饲粮,每天灌胃0.2 mL的生理盐水;试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠饲喂基础饲粮,每天分别灌胃1×10^(8)和1×10^(9)CFU/mL的牛源罗伊氏乳杆菌菌悬液0.2 mL;在正式试验第18~22天,对照组小鼠每天灌胃0.2 mL的生理盐水,其他3组小鼠每天灌胃5×10^(9)CFU/mL的ETEC菌悬液0.2 mL进行攻毒。结果显示:1)ETEC攻毒后,与对照组相比,攻毒组小鼠平均日增重显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的平均日增重则无显著变化(P>0.05)。2)ETEC攻毒后,与对照组相比,攻毒组小鼠胸腺指数显著降低(P<0.05),心脏指数显著升高(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的胸腺指数和心脏指数则无显著变化(P>0.05)。3)ETEC攻毒后,试验Ⅱ组小鼠血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和白细胞介素-10含量显著高于攻毒组(P<0.05),白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β含量显著低于攻毒组(P<0.05)。4)ETEC攻毒后,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于攻毒组(P<0.05),丙二醛含量显著低于攻毒组(P<0.05);此外,试验Ⅱ组小鼠血清中超氧化物歧化酶活性也显著高于攻毒组(P<0.05)。5)ETEC攻毒后,与攻毒组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠血清中二胺氧化酶活性显著降低(P<0.05),且试验Ⅱ组小鼠血清中D-乳酸和内毒素含量显著降低(P<0.05)。6)与对照组相比,攻毒组小鼠空肠绒毛高度显著降低(P<0.05),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠空肠绒毛高度则无显著变化(P>0.05)。综上所述,牛源罗伊氏乳杆菌能够缓解ETEC攻毒引起的小鼠体重下降,提高机体免疫性能和抗氧化能力,减轻ETEC感染导致的脏器及肠道损伤。

槲皮素对产肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪肠上皮细胞凋亡和焦亡信号通路的影响

本试验旨在研究槲皮素(Que)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪肠上皮细胞损伤、炎症反应、凋亡和焦亡信号通路的影响。试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,分为4组:对照组、Que组、ETEC K88组、Que+ETEC K88组。用0或10μmol/L Que处理细胞24 h后,再用磷酸盐缓冲液(PBS)或50倍细胞数的ETEC K88刺激细胞2 h,收集样品测定细胞活力、细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞中炎性因子含量、细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因的mRNA表达水平。结果显示:1)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞活力的下降和细胞上清液中LDH活性的上升(P<0.05)。2)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的上升(P<0.05)。3)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞凋亡信号通路相关基因凋亡相关因子配体(FasL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平的上升和B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的mRNA表达水平的下降(P<0.05)。4)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞焦亡信号通路相关基因含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、IL-18、消皮素D(GSDMD)和NLR家族CARD结构域4(NLRC4)的mRNA表达水平的上升(P<0.05)。综上所述,Que可抑制ETEC K88刺激导致的IPEC-1细胞凋亡和焦亡信号通路的激活,缓解细胞损伤。

富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

发酵香肠中产志贺毒素大肠杆菌存活和毒力基因表达变化

以产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)主要血清型O157:H7和O26:H11为实验菌,进行发酵香肠接种实验,研究发酵香肠生产过程中这两种菌的存活情况,并采用反转录实时聚合酶链式反应(reverse transcription real-time polymerase chain reaction,RT-real-time PCR)的绝对定量方法分析不同生产阶段菌体和产品中毒力基因表达变化。结果显示:STEC接种组与未接种组之间乳酸菌数、乳酸含量、pH值、a_(w)值在大多生产阶段无显著差异。香肠生产过程中大肠杆菌O157:H7和O26:H11存活菌数分别减少了1.51(lg(CFU/g))和1.39(lg(CFU/g)),均受到显著抑制(P<0.05),但两菌呈现出不一样的受抑制过程。采用RT-real-time PCR绝对定量,消除菌数差异后发现菌体毒力基因表达在生产后期均显著上调(P<0.05);单位质量香肠中大多毒力基因表达量在发酵初期显著增加(P<0.05),且所有毒力基因在生产末期终产品中仍有较高表达量。本研究表明:虽然发酵香肠生产过程中能有效抑制STEC,但却增强了菌体毒力基因的表达,且终产品中毒力基因存在较高表达量。

生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用

本试验旨在研究生物活性肽(BTP)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用。选用6周龄体重为(18±2)g的C57BL/6小鼠40只,随机分为4组,分别为对照组、ETEC组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组10只。试验期共15 d,在第8~14天,空白对照组和阴性对照组小鼠每天灌胃0.1 mL的磷酸盐缓冲液(PBS),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠每天分别灌胃150和300 mg/kg的BTP(溶于0.1 mL PBS中);在第15天,空白对照组小鼠灌胃0.2 mL的PBS,阴性对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠灌胃5×109 CFU/mL的ETEC菌悬液(重悬于0.2 mL PBS中),连续观察8 h后进行屠宰。结果表明:1)与空白对照组相比,阴性对照组小鼠的存活率显著降低(P<0.05),腹泻指数显著升高(P<0.05);空肠肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),白细胞介素-1β(IL⁃1β)、白细胞介素-6(IL⁃6)含量显著升高(P<0.05);空肠闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO⁃1)、闭锁小带蛋白-2(ZO⁃2)、转录因子核受体77(Nur77)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05)。2)与阴性对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的存活率显著升高(P<0.05),腹泻指数显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的空肠TNF⁃α的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),IL⁃1β、IL⁃6含量显著降低(P<0.05);试验Ⅱ组的空肠Occludin和Nur77的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的血清MDA含量显著降低(P<0.05),试验Ⅱ组的血清GSH⁃Px活性显著升高(P<0.05)。综上所述,BTP能够缓解ETEC感染导致的小鼠肠道炎症及屏障功能损伤,该作用可能与BTP上调了Nur77表达,抑制小肠上皮细胞凋亡、坏死性凋亡及焦亡有关。

内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的调查研究

为了阐明内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的流行情况,该研究以内蒙古自治区乌兰察布和鄂尔多斯地区部分牛场腹泻病例为研究对象,采集患病犊牛样本,采用PCR方法检测产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)的ST和LT基因进行ETEC菌株鉴定。研究结果显示,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率为11.71%,鄂尔多斯地区ETEC总阳性率为9.44%,其中0~2月龄阳性率为21.49%,2~6月龄阳性率为5%,6~18月龄阳性率为0。由此可知,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率高于鄂尔多斯地区,两个地区ETEC的流行情况和感染情况均以0~2月龄犊牛为主,为进一步开展犊牛腹泻疾病的防控提供了依据。

仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施,疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述,并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战,提出了高效疫苗的研究策略,旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。

产肠毒素大肠杆菌对断奶仔猪肠道形态、紧密连接蛋白及细胞外基质的影响

【目的】探究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)对断奶仔猪肠道形态、紧密连接蛋白及细胞外基质(ECM)表达的影响。【方法】选取35日龄杜长大断奶仔猪12头,随机分成2组(每组6个重复,每个重复1头):对照组灌喂20 mL生理盐水;产肠毒素大肠杆菌组(K88组)灌喂20 mL 1×10^(9)CFU/mL ETEC K88悬浮液,连续灌喂3 d。试验期间所有仔猪自由采食和饮水,在试验第1和4天,以重复为单位称量仔猪体重,记录耗料量。计算每组的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G);在试验第4天屠宰并采集肠道组织样品,切片观察空肠和回肠的组织形态以及肠道内胶原纤维的含量;采用实时荧光定量PCR分析肠道紧密连接蛋白基因的表达;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定ECM中胶原蛋白分子以及调控酶系的表达。【结果】与对照组相比,K88组仔猪平均日增重显著降低(P<0.05),平均日采食量极显著降低(P<0.01);空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值极显著降低(P<0.01),回肠的绒毛高度也显著降低(P<0.05);空肠闭锁蛋白(Occludin)mRNA表达量显著降低(P<0.05),闭合蛋白-1(Claudin-1)mRNA表达量极显著降低(P<0.01),回肠闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、Occludin mRNA表达量极显著降低(P<0.01),Claudin-1 mRNA表达量也显著降低(P<0.05);空肠、回肠胶原纤维含量显著减少(P<0.05);空肠Ⅳ型胶原蛋白α2链(COL4A2)、COL5A1、COL6A1的mRNA表达量极显著降低(P<0.01),空肠COL4A2以及COL6A1蛋白表达量均显著降低(P<0.05);空肠基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),纤溶酶原激活物(PAs)的mRNA相对表达量则极显著降低(P<0.01);MMP9蛋白含量极显著提高(P<0.01)。【结论】灌喂ETEC K88降低了断奶仔猪平均日增重以及平均日采食量,损伤肠道形态并降低肠道紧密连接蛋白的表达。并且可通过减少肠道中胶原纤维的含量、降低胶原蛋白分子以及ECM调控酶系的表达进而造成肠道中ECM的变化。

产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌多重荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立能同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中产肠毒素大肠杆菌ST和LT基因及沙门氏菌invA基因序列设计引物和探针,通过优化扩增体系中引物和探针剂量建立检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,分析该方法的特异性、敏感性和重复性,用建立的方法对85份临床样品进行检测,并与实验室传统血清学分离鉴定方法进行比较。结果表明:在ST基因的最佳引物和探针剂量为0.4μL、0.8μL,LT基因的最佳引物和探针剂量为0.6μL、1.0μL,invA基因的最佳引物和探针剂量为1.0μL、1.2μL时,扩增曲线良好,ST基因、LT基因、invA基因的标准曲线回归方程相关系数(R2)分别为0.975,0.968,0.915,扩增曲线具有良好线性关系;建立的多重荧光定量方法对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等细菌核酸无交叉反应;组内重复变异系数均低于2%,且产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的最低检出浓度均为1×10^(1)copies/μL;从85份临床样品中检出产肠毒素大肠杆菌20份,沙门氏菌阳性样品10份,双阳性样品2份,与实验室传统血清学分离鉴定方法的符合率为94.12%。说明试验建立的多重荧光定量PCR方法的特异性好、敏感性强,稳定性高,具有良好的使用前景。

产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制

目的利用PCR和基因定点突变技术,分别扩增出K88ac、K99、LTB和突变的ST1基因,构建了重组菌株BL21(DE3)(pXKKSL4),酶切鉴定和序列分析表明构建的pXKKSL4表达载体包含有K88ac-K99-3ST1-LTB融合基因且阅读框架正确。方法SDS-PAGE分析表明融合蛋白占菌体总蛋白含量的35.72%。ELISA检测证实融合蛋白能与ST1单抗、LTB、K88ac和K99抗体相结合。结果乳鼠灌胃实验表明K88ac-K99-3ST1-LTB融合蛋白已失去ST1天然毒性,免疫保护试验表明菌株氢氧化铝佐剂苗和包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗均具有良好的免疫效果,其免疫保护率分为98%和96%。结论上述研究表明构建的四价灭活疫苗不但解决了ST1肠毒素毒性问题,而且又赋予其免疫原性,同时增加K99菌毛可使免疫效果进一步增强,这样从肠毒素和菌毛两种途径,达到预防由ETEC引起的腹泻目的,从而有效控制腹泻的发生,为将来制备产肠毒素大肠杆菌基因工程灭活疫苗打下坚实基础。

产肠毒素大肠杆菌K88对BALB/c小鼠肝脏炎症反应、程序性坏死和焦亡信号通路关键基因表达的影响

本试验旨在研究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88对BALB/c小鼠肝脏炎症反应、程序性坏死和焦亡信号通路关键基因表达的影响。试验选取25只9周龄、体重(17±1)g的雌性BALB/c小鼠,随机分为5个组,每组5只,每只小鼠腹腔注射1×10^(7) CFU/mL ETEC K88菌液0.2 mL;分别于注射ETEC K880、12、24、36和48 h时屠宰小鼠,取肝脏组织测定炎性因子、程序性坏死和焦亡信号通路关键基因mRNA的表达。结果表明:1)与0 h相比,小鼠肝脏中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA相对表达量在24、36和48 h时显著升高(P<0.05),白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA相对表达量在12和36 h时显著升高(P<0.05),白细胞介素-6(IL-6)的mRNA相对表达量在36和48 h时显著升高(P<0.05);2)与0 h相比,小鼠肝脏中受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的mRNA相对表达量在12 h时显著升高(P<0.05),受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)的mRNA相对表达量在36 h时显著升高(P<0.05),混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)的mRNA相对表达量在12、36和48 h时显著升高(P<0.05);3)与0 h相比,小鼠肝脏中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的mRNA相对表达量在36 h时显著升高(P<0.05),凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的mRNA相对表达量在12、36和48 h时显著升高(P<0.05),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)的mRNA相对表达量在24和36 h时显著升高(P<0.05),消皮素D(GSDMD)的mRNA相对表达量在12、24和36 h时显著升高(P<0.05),白细胞介素-18(IL-18)的mRNA相对表达量在24 h时显著升高(P<0.05)。综上所述,ETEC K88感染引起小鼠肝脏炎症反应,激活了小鼠肝脏程序性坏死和焦亡信号通路。

牛源产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定与致病性研究

为了解呼和浩特市周边部分犊牛养殖场产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)的流行趋势,本研究采集呼和浩特市周边地区2个牧场腹泻粪样22份,进行大肠杆菌分离鉴定。利用qPCR方法鉴定分离菌株的毒力基因,筛选出ETEC菌株,利用PCR方法检测ETEC分离菌株O抗原血清型;选取其中3株与实验室提供的1株ETEC阳性菌株进行小鼠致病性试验。结果表明:22份样品中14份样品ETEC呈阳性,致病性试验得到2株有致病力菌株8-1、D2,经测定8-1菌株半数致死量(LD50)为5×108 CFU/mL,绝对致死量(LD100)为9×108 CFU/mL;D2菌株LD50为1.2×109 CFU/mL,LD100为2×109 CFU/mL。经PCR鉴定D2菌株O抗原血清型为O2,8-1菌株为O118。由此得出,分离出的2株菌株有致病力,血清型明显。

内蒙古巴彦淖尔市部分规模化牛场产肠毒素大肠杆菌F5流行病学调查

为了解内蒙古巴彦淖尔地区规模养殖场由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F5菌毛引起的腹泻流行情况,采集巴彦淖尔市规模化养牛场284份血样和300份粪样,采用ELISA和PCR方法进行了产肠毒素大肠杆菌F5抗体及分子流行病学调查,结果显示:产肠毒素大肠杆菌F5抗体总阳性率为6.34%,抗原总阳性率为27.00%;在采集的样品中,0~2月龄犊牛的抗原阳性率最高,为20.67%,抗体阳性率为4.23%,表明巴彦淖尔地区ETEC F5在0~2月龄犊牛中流行,应进一步开展犊牛腹泻疾病的防控。

齐齐哈尔地区致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌毒力及耐药基因的检测

为了了解黑龙江省齐齐哈尔地区致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌携带的毒力基因及耐药基因情况,试验对采集的156份样本(腹泻病死仔猪器官样本123份,粪便样本33份)进行大肠杆菌的分离纯化及分子生物学鉴定,并对分离的大肠杆菌菌株进行小鼠致病性试验、毒力基因检测、药敏试验及耐药基因检测。结果表明:分离鉴定到148株大肠杆菌,其中112株具有致病性,致病性大肠杆菌中有87株携带产肠毒素大肠杆菌毒力基因,其中携带LT、K88、987P毒力基因的大肠杆菌检出率较高,分别为31.03%、28.74%、20.69%。87株产肠毒素大肠杆菌中链霉素、阿米卡星和头孢唑啉的耐药菌株较多,分别为56,53,52株。共检出56株产肠毒素大肠杆菌携带耐药基因,其中携带TEM耐药基因的菌株总检出率最高,达到48.21%;其次是CTX-M基因,总检出率为28.57%;再次是qnr基因,总检出率为25.00%。说明齐齐哈尔地区仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌主要携带LT、K88、987P毒力基因和TEM、CTX-M、qnr耐药基因。

利用绿色荧光蛋白标记产肠毒素大肠杆菌F4ac

利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4ac中,获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结果显示,转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因,且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光;将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验,在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性,且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。

生鲜肉中产毒素大肠杆菌多重PCR检测方法构建

大肠杆菌及其致病菌株是生鲜肉中的主要污染菌株,对其检测和控制是保证肉品质量的关键。本研究拟构建基于选择性快速增菌和多重PCR的生鲜肉中产毒素大肠杆菌检测方法。以大肠杆菌种属特异基因uidA、ETEC不耐热肠毒素基因lt和耐热肠毒素基因sta为PCR靶基因,通过引物特异性筛选,ETEC选择性增菌和分离,PCR反应条件优化等手段,对不同肉样中的ETEC进行检测。结果显示:25μL PCR反应体系,退火温度为60℃,引物添加量为0.8μL (10μmol/μL)时,PCR多重扩增稳定性和特异性最佳。经LST肉汤选择增菌和伊红美蓝鉴别平板分离,肉样中ETEC的最低检测限值为4 CFU/10 g。本研究建立的方法操作简便,稳定性、特异性强,可用于生鲜肉中ETEC的快速检测。

产肠毒素大肠杆菌的生长曲线测定及活菌计数

判断ETEC的对数生长期,并探讨OD600值与ETEC活菌数之间的相关性。方法 采用分光光度计测定ETEC菌液不同生长时间的OD600值,绘制ETEC生长曲线;将OD600值为0.8-1.0的ETEC菌液作为原菌液,将原菌液按不同稀释倍数进行稀释,分别测定其相应的OD600值,并涂血琼脂平板,培养后对菌落进行计数。结果 培养30-150 min为ETEC的对数生长期;OD600值与ETEC活菌数呈线性相关,线性回归方程为y=0.23+0.131x,R2=0.96,OD600值(x),菌落数目(y×109)∕ml。结论 运用OD值法可以准确、简便的判断ETEC的对数生长期及对菌液中的产肠毒素大肠杆菌进行活菌计数。

腹泻牦牛产毒素大肠杆菌感染情况调查及耐药性检测

为了解腹泻牦牛产毒素大肠杆菌(ETEC)的感染情况及分离菌株的耐药情况,试验采用麦康凯平板对2015年10月份采自川西北甘孜州和阿坝州腹泻牦牛的新鲜粪便样品,进行ETEC的分离培养和ETEC K99基因PCR扩增鉴定,并对ETEC K99阳性菌株进行耐热肠毒素(ST)和热敏性肠毒素(LT)基因PCR扩增,K-B纸片扩散法做耐药性检测。结果表明:48份腹泻粪便中检出41份ETEC,ETEC K99检出率85.4%(41/48),而ST检出率9.76%(4/41),LT未检出;所有ETEC菌株对美罗培南和头孢唑啉100%敏感,对其他头孢类、喹诺酮类和氨基糖苷类敏感性高于90%,对阿莫西林/克拉维酸不敏感。可见分离鉴定的腹泻牦牛ETEC对大部分药物的敏感性较高,头孢唑啉可治疗由ETEC引起的牦牛腹泻。