产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为54ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。

B型产气荚膜梭菌C58-1株ε毒素基因序列分析与可溶性表达

利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌扩增出ε毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收984bp的ε毒素基因片段,将其定向克隆在载体PET-32a中,获得重组质粒pETε984。将pETε984转化至受体菌BL21(DE3)中。重组菌株经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PACE分析。结果表明,重组目的蛋白在大肠埃希菌成功表达,融合蛋白大小为51ku,存在于细菌培养上清中,可溶性蛋白占菌体总蛋白相对含量的67.8%。序列分析表明C58-1株ε毒素蛋白序列与目前公布的所有B型和D型产气荚膜梭菌同源性均在99.7%以上,但ε毒素蛋白序列第321位出现了S→Y突变。研究结果为ε毒素蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。

产气荚膜梭菌D型、B型提纯抗原冻干后的保存期与抗原性

原生产羊梭菌病灭活疫苗的羊肠毒血症 (产气荚膜梭菌D型 )、羔羊痢疾 (产气荚膜梭菌B型 )冻干干粉85 0 2批 (干粉分别保存 )在 2～ 8℃保存 17年后 ,与 2 0 %铝胶生理盐水配成疫苗 ,以 2、4、6、8和 12mg剂量免疫家兔 ,采血分离血清 ,与产气荚膜梭菌D型、B型相应毒素作中和试验 ,测定血清中和效价 ,检验两种干粉的抗原性。结果表明 ,干粉抗原保存 17年后 ,其羔羊痢疾、肠毒血症干粉抗原最小免疫剂量由制出时的 4mg下降为 6mg ,证明B型、D型干粉抗原 6mg免疫剂量所产生的羔羊痢疾、猝狙。

B型产气荚膜梭菌对补硒母羊产新生羔羊的攻击试验

采用人工攻击 B型产气荚膜梭菌的方法 ,观察了 B型产气荚膜梭菌对青海三角城羊场补硒羊只的致病性 ,结果表明 ,B型产气荚膜梭菌不引发补硒母羊产新生羔羊的羔羊痢疾。

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、β及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符。

规模化羊场B型产气荚膜梭菌分离鉴定及生物学特性检测

2016年,山东某规模化羊场新生羔羊暴发腹泻,并伴急性毒血现象,出现部分死亡个例。对该羊场的病死羔羊进行剖检,分离4株特征病原菌（分别命名为Cp1、Cp2、Cp3、Cp4）,对病菌的形态特点、生化特性以及毒素基因序列进行PCR检测,最终确定病原菌为产气荚膜梭菌。PCR检测结果显示该菌的毒素基因有α毒素、β毒素和ε毒素;毒素毒力试验表明,产气荚膜梭菌毒素对小鼠有强致病性,并证明产气荚膜梭菌通过释放毒素致病而本身并不具有致病性;药敏试验发现,分离菌对青霉素、四环素、庆大霉素、复方新诺明和强力霉素的耐药率极高,可达85%以上,而对头孢噻肟、氯霉素、氟苯尼考、链霉素和恩诺沙星等有较强的敏感性;结合传统免疫措施配合抗生素药物的治疗,可一定程度控制该病的流行。本试验结果为羊B型产气荚膜梭菌病的防治提供了试验依据。

牛源B型产气荚膜梭菌的分离鉴定与毒力基因检测

为探究内蒙古通辽市某牛场牛猝死的原因,本研究采集病死牛肠道内容物,分别进行革兰染色镜检、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、毒力基因检测及系统进化树分析、动物致病性试验、半数致死量试验。结果显示,分离菌形态、生化特性符合产气荚膜梭菌的特性;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的产气荚膜梭菌的同源性为99%,系统进化树分析该分离菌与B型产气荚膜梭菌的亲缘性最近;3种毒力基因在该致病菌中均被检测到;分离菌对小鼠有致死性;该菌对小鼠半数致死的浓度为2.27×107CFU/mL;药敏结果显示,分离菌株对多黏菌素、庆大霉素等药物敏感,对卡那霉素等药物中度敏感,对头孢他啶、阿莫西林等药物耐药。该致病菌经鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌,毒力基因分别为α、β2和ε毒素。

AgrB信号分子对B型产气荚膜梭菌生物被膜形成的影响

目的探讨QS系统AgrB分子对B型产气荚膜梭菌生物被膜(biofilm, BF)形成过程中htrA、rpoA基因表达水平的影响。方法体外培养B型产气荚膜梭菌12、24、36、48、56及64 h时期的BF,提取其总RNA,通过实时Real-Time PCR检测不同时间段B型产气荚膜梭菌BF agrB基因对BF形成相关基因htrA、rpoA表达的调节作用。结果 B型产气荚膜梭菌在24、36、48、56及64 h 5个时间段中,QS系统agrB基因和BF rpoA、htrA基因相对表达量均呈现出先增高后降低的趋势,且在36 h达到峰值。在峰值前期,agrB、rpoA、htrA基因的表达量较高,48 h后表达量迅速下降,提示B型产气荚膜梭菌BF形成相关基因rpoA、htrA的表达受到QS系统agrB基因表达的影响。结论 AgrB信号分子对rpoA、htrA基因调控表达趋势在产气荚膜梭菌BF形成过程呈现关联性。

羔羊痢疾的流行病学、临床特征、剖检变化及其防控

羔羊痢疾是由于感染B型产气荚膜梭菌而发生的一种急性毒血症,主要是小于1周龄的新生羔羊出现发病,其中小于4日龄的羔羊易感性最高,病羔羊主要特征是严重腹泻、小肠存在溃疡。该病急性发生,病程持续时间短,病死率较高,具有明显的季节性,一般在气候寒冷和气候多变的时节发生,往往呈地方性流行。如果发病后没有及时进行诊断和采取有效的防治措施,会导致大批羔羊死亡,严重损害养羊业的经济效益。

1例羔羊痢疾的诊治

某山羊养殖户羊舍简陋,对防寒保暖设施建设意识淡薄,在冷空气突袭来临之前未做好分娩母羊舍的保暖,诱导羔羊痢疾的发生,造成部分羔羊因病死亡,影响了羊农养殖经济效益。为有效控制羔羊痢疾的蔓延,制定针对性治疗方案与防控措施,取得显著治疗效果。

羔羊痢疾病原体的分离与PCR鉴定

羔羊痢疾是由B型产气荚膜梭菌引起的新生羔羊的一种急性毒血症,临床以严重腹泻、脱水,剖检以小肠形成溃疡灶为主要症状。本试验从疑似病料中分离到病原体,通过病原体的实验室诊断和PCR鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌。本试验的研究为羔羊痢疾病快速诊断、流行病学研究提供了科学依据,为建立多重PCR诊断方法奠定了基础。