微波诱变选育耐酸高效厌氧产氢菌

为获得厌氧产氢菌的高效突变株,以产氢菌H-8为原始菌株进行微波诱变处理,对微波诱变参数进行了优化,考察了突变株的遗传稳定性、产氢特性及耐酸性.经过微波(低火)物理诱变得到5株高产氢突变株HW7、HW33、HW181、HW184和HW195,多次传代实验表明,HW195是稳定的高产突变株.突变株HW195具有较好的耐酸性,在pH值为2·8时仍能生长.通过间歇发酵实验,其最大产氢量和最大产氢速率分别达到2460mL/L培养基和340mLL-1h-1,比原始菌分别提高了50·7%和41·7%.

一个新的高温产氢菌及产氢特性的研究

利用Hungate滚管技术从西藏山南地区热泉淤泥中分离到一株高温产氢的厌氧发酵细菌T42。菌株T42革兰氏染色反应为阴性,但KOH裂解试验证实其为革兰氏阳性杆菌。菌体大小为0.7μm^0.9μm×3.2μm^7μm,不运动,不产芽孢。其生长温度范围为32℃~69℃,最适生长温度为60℃~62℃,生长pH范围为5.0~8.8,最适生长pH为7.0~7.5,代时30min。有机氮源是T42菌株的必需生长因子。菌株T42利用淀粉、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、果糖、糖原和海藻糖等底物生长并发酵产氢,发酵葡萄糖的终产物为乙酸、乙醇、H2和CO2。G+C含量为31.2mol%。系统发育分析表明菌株T42与Thermobrachium celere和Caloramator indicus位于同一分支,生理生化特征也表明菌株T42应是Thermobrachium属的一个新菌株,在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为AS1.5039。菌株T42的最佳产氢初始pH为7.2,最佳产氢温度为62℃,其氢转化率为1.06mol H2/mol葡萄糖,最大产氢速率为24.0mmol H2/gDW/h。20mmol/L的Mg2+和2mmol/L的Fe2+可分别提高菌株T42的产氢量20%和23.3%,而Ni2+对其产氢无明显的作用。当菌株T42和热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)Z245共培养时,由于降低了氢分压,使其葡萄糖利用率和氢产量分别提高1倍和2.8倍,发酵产物乙酸和乙醇的比例也从1提高到1.7。

产氢菌Enterobacter sp.和Clostridium sp.的分离鉴定及产氢特性

在高温水体中分离得到2株具有较高产氢活性的微生物菌株Z-16和C-32。根据两菌株的16SrDNA序列分析,初步鉴定菌株Z-16为Enterobactersp.,菌株C-32为Clostridiumsp.。研究了起始pH值、反应温度、碳源等对菌株放氢活性的影响。菌株Z-16的最适产氢条件为:反应系统起始pH7·0,反应温度35℃,以蔗糖为产氢底物。在最适条件下,菌株Z-16的氢转化率为2·68molH2/mol蔗糖。菌株C-32的最适产氢条件为:反应系统起始pH8·0,反应温度35℃,以麦芽糖为产氢底物。在最适条件下,菌株C-32的氢转化率为2·71molH2/mol麦芽糖。以葡萄糖为碳源时,菌株Z-16和菌株C-32的氢转化率分别为2·35和2·48molH2/mol葡萄糖。

红树林混合发酵产氢菌群中梭菌属Fe-氢酶基因(hydA)的克隆及序列分析

采用间歇产气试验方法对红树林淤泥中的混合菌群进行产氢菌群富集,并对混合产氢菌群发酵产氢过程中发酵液的pH值和氧化还原电位(ORP)的变化进行分析。此外,在产氢速率最高时段,发酵液中菌群经过常规的基因组提取,分别采用通用的梭菌属Fe-氢酶基因和16S rRNA基因引物进行PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。结果发现产氢菌群中至少有6种,而Fe-氢酶基因只含有一种。将Fe-氢酶基因的扩增片段切胶纯化之后,经PCR重新扩增、纯化,克隆测序。NCBI序列比对结果表明,该片段序列与产气荚膜梭菌Fe-氢酶基因的序列相似性达99%。根据已知产气荚膜梭菌Fe-氢酶基因序列设计引物,经两轮PCR扩增获得Fe-氢酶基因全序列。混合菌群中Fe-氢酶基因GenBank数据库的登录号为EU590683。此外,采用Bioedit和Mega2软件构建了Fe-氢酶的NJ系统进化树,结果表明该Fe-氢酶基因与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)聚为一类。推测的氨基酸序列与产气荚膜梭菌的相应序列相似性达97%—99%。PfamHMM结构域查找结果发现,此氢酶含有五个结构域,分别为1个2Fe-2S铁硫簇结合区域、2个4Fe-4S结合区域、Fe-氢酶大亚基和Fe-氢酶小亚基。

生物制氢系统产氢菌的富集培养与分离技术

从生物制氢反应器中富集、分离培养发酵产氢细菌并发挥其最大产氢能力，可以提高高浓度有机废水制氢系统的产氢性能。采用活性污泥混合培养发酵反应器和设计培养基研究产氢菌的富集培养和分离。将连续流发酵法生物制氢系统的运行参数调整如下：pH值为4．0～4．2，温度为35～38℃，氧化还原电位（ORP）为-100mV，反应器运行40～50d，使之达到产氢最佳的乙醇型发酵阶段，初步富集以产氢菌为优势群落的活性污泥；以葡萄糖、果糖和麦牙糖为碳源，以蛋白胨和牛肉膏为氮源，设计HPB—LR培养基，严格厌氧条件下，可以有效地富集培养产氢发酵细菌。采用改良Hungater技术、厌氧管斜面法和平板培养瓶厌氧技术等3种厌氧培养技术分离培养产氢菌效果最佳。获得产氢菌94株，这些菌株经过筛选鉴定，获得3株高效产氢菌。这些菌株为发酵法生物制氢工程提供了宝贵的微生物种质资源。

高温产氢菌的一种简单筛选法

在实验中常采用改良Hungate技术、斜面法和平板培养瓶法来进行产氢菌的分离与纯化,但如果事先对所用的样品(材料)进行一些必要的预处理,达到一定的前期选择性培养的效果,就能减少随后的工作量。通过利用简单的酸处理与热处理相结合的方法,并结合平面厌氧操作技术与培养瓶厌氧技术,成功的分离得到了一株高温产氢菌。此菌在45～50℃范围内具有较强的产氢能力。电镜观察表明:此菌为长杆状,无鞭毛。在对此菌进行热处理时,实验结果显示:85℃下处理10min是适宜的。

厌氧发酵过程中产氢菌源的预处理方法及其影响因素

厌氧发酵制氢可利用包括工农业废弃物在内的多种有机物作为基质产生氢气。其优点是耗能少,成本低廉,有巨大的应用前景和发展潜力。但在实际应用中,存在着基质利用率较低、发酵产氢微生物不易获得和培养等问题。本文综述了厌氧发酵产氢过程中的混合菌筛选技术,比较了不同的预处理方法,包括物理处理(热处理、微波,超声,紫外、冷冻解冻、曝气处理)、化学处理(酸碱处理、化学试剂)和电处理等,但是,不同的预处理方法中仍存在不同的缺陷,在此基础上对厌氧发酵产氢的预处理过程提供了全新的发展方向。除了菌源的预处理之外,影响厌氧发酵过程的因素还有很多,例如p H值、温度、水力停留时间、Fe2+浓度以及C/N/P比例等,本文逐一介绍了这些因素对厌氧发酵过程中的影响。

产氢菌株Clostridium sp.T7的快速筛选

取自潮间带的污泥分别在不同温度下(80、100、121,℃)进行热休克预处理,富集产氢菌群并测定其产氢量,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析混合菌群组成.结果表明:3种热处理条件下混合菌群的产氢量都要高于对照未处理菌群.DGGE图谱表明,与80、100,℃热休克处理混合菌群相比,经121,℃热休克处理富集的混合菌群,其电泳条带最少,测序结果发现该混合菌群中包括产氢菌Clostridium sp..从该混合菌群中纯化并鉴定了1株产氢菌株Clostridiumsp.T7(登录号HM104461).培养温度对菌株T7产氢有一定影响,温度在25～55,℃范围内菌株Clostridium sp.T7都能产氢,最适产氢温度是35,℃.

产氢菌的投加方式对强化发酵菌群产氢的影响

通过间歇培养研究了产氢菌Ethanoligenens sp B49的投加方式对生物制氢反应器的混合发酵菌群生物强化作用的影响。结果表明,产氢菌的投加方式对发酵菌群的产氢能力有显著影响。产氢菌发酵液的直接投加使发酵菌群的产氢能力下降,并引起培养液中发酵产物乙醇和乙酸浓度的显著增加。分析认为,产氢菌发酵液对发酵菌群的末端产物抑制和低pH值抑制作用是导致产氢作用受到抑制的主要原因。离心后单独投加产氢菌菌体可提高发酵菌群的产氢能力,起到强化产氢的作用。投加10.8%的产氢菌强化发酵菌群时,培养45h的累计产氢量为155.0 mL,比强化前发酵菌群培养的产氢量提高了21.5%。因此在利用产氢菌生物强化发酵菌群的研究中,应采用离心分离后单独投加产氢菌菌体的方式进行生物强化。

硫源对高温厌氧产氢菌Caldicellulosiruptor changbaicum发酵产氢的影响

以从长白山温泉中筛选到的高温厌氧产氢菌Caldicellulosiruptor changbaicum为菌种，研究硫源对其发酵纤维素产氢的影响。先以Na2 S、Na2 SO4、Na2 SO3和Na2 S2 O3为硫源进行单因素试验，考察硫源对菌株生长和产氢的影响。然后在生物反应器中分别以Na2 S和Na2 S、Na2 S2 O3混合物为硫源进行厌氧发酵试验。结果在以Na2 S∶Na2 S2 O3＝1∶2的混合物为产氢菌提供硫元素时，发酵液pH值呈稳定下降趋势，产气稳定时的平均速率为90～100 mL／（ L· h），氢气的转化效率达到7．73 mmol／g VS，说明Na2 S、Na2 S2 O3混合硫源有利于该高温厌氧菌发酵纤维素产氢。

产氢菌的分离鉴定及发酵性能

为了获得高性能的产氢菌,从碱处理后活性污泥中分离纯化得到两株产氢菌(H-1和H-2),生物学鉴定表明两株菌均为Enterobacter种属,H-1菌为Enterobacter cancerogeous HG6 2A种属,而H-2与Enterobacter homaechei 83的关系最亲近。发酵实验结果表明,将H-1和H-2菌液进行1∶1混合时发酵性能最佳,对应的发酵时间和产氢量分别为33h和861m L/L,混合发酵克服了H-1菌单独发酵氢产量低和H-2菌发酵时间长的缺陷。发酵液中主要挥发性脂肪酸(VFA)为乙酸和丁酸,表明两株菌的发酵类型均为丁酸型发酵。由于两株菌的协同作用,混合发酵初期VFA的累积速率降低,提高了发酵体系的稳定性。

大熊猫粪便微生物多样性分析及纤维素降解产氢菌的筛选鉴定

利用宏基因组测序技术对大熊猫粪便微生物进行了多样性分析,发现大熊猫粪便样品中含有大量可以降解纤维素的厌氧微生物种类,如梭菌科、瘤胃菌科和毛螺菌科等,因此,将熊猫粪便样品作为降解纤维素微生物菌种分离的来源具有可行性。采用刚果红染色法从大熊猫粪便样品中筛选具有降解纤维素产氢能力的菌株,分离获得1株纤维素降解产氢菌株Cel10,根据菌株的形态和生理生化特征并结合分子生物学,鉴定菌株Cel10属于缓纤维梭菌(Clostridium lentocellum),其16S rDNA序列的同源性为98%。菌株Cel10在pH 4.0～8.0、温度25～50℃范围内可以利用纤维素进行生长,其最适pH 7.0,最适生长温度37℃。本文丰富了大熊猫肠道纤维素降解菌的种类,为木质纤维素类农产品加工废弃物的开发和综合利用提供了良好的菌种资源和科学依据。

不同pH下瘤胃液中纤维素降解产氢菌群的性能

为了提高纤维素类有机质的降解率并了解牛瘤胃内微生物的种类及功能,从瘤胃液中以不同初始pH为基础定向培育稳定高效的降解群落,利用PCR-DGGE技术对菌落结构及菌种功能进行分析。结果表明,该菌群对以5g/L微晶纤维素为碳源的发酵液的利用率最高,达到83%;在pH 6.5时获得了较高的产氢量(178.2mL/L),此降解效率及产氢量均高于已报道的纤维素降解菌群。对群落结构分析发现,传代驯化4次后群落结构基本稳定,此群落中含有的菌种主要包括:具有纤维素降解功能的瘤胃菌(Ruminococcaceae),具有产氢能力细杆菌(Anaerofilum)以及降解纤维素并产生氢气的肠球菌(Enterococcus)、梭菌类(Clostridium)和肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

高温产氢菌的分离及其发酵木糖产氢特性研究

利用改进的Hungate厌氧技术从堆肥中分离出一株能有效利用木糖发酵产氢的高温菌D22．菌株D22革兰氏染色为阴性、显运动性、产芽孢，有鞭毛．其生长的温度范围是30～71℃，最适温度为59～61℃，耐受pH值范围是4．5—8．0，最适pH值范围是6．5～7．0．菌株D22可以利用淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、绵子糖、CMC、七叶苷、半乳糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、糖原、甘露糖、赤薛糖醇、菊糖等碳源生长并发酵产氢．有机氮源不是其必需的生长因子．D22发酵木糖的终产物为H2、CO2、乙酸和乙醇系统发育树分析表明菌株D22与Thermoanaerobacterium saccharolyticum相似性最高达98．4％，生理生化特征表明菌株D22应是Thermoanaerobacterium属的一个新菌株．以木糖为碳源时，最佳生长产气碳源浓度是50mmol／L．在60℃，初始pH值为7．0条件下，其氢气的转化率可以达到1．44mol H2／（mol木糖），最大产氢速率为16．42mmol H2／（gDW·h^-1）．

投加产氢菌对猪粪厌氧发酵产沼气的影响

为研究猪粪厌氧发酵产沼气时投加产氢菌对反应体系发酵产气的影响,进行了产氢菌的投加量试验以及投加时间的比较试验。实验结果显示,投加0.5%,1%,2%,4%的产氢菌均能提高沼气总产量,其累积总产气量从大到小为1%>4%>0.5%>2%,而对甲烷浓度没有明显的影响,其中最适投加量1%的累积产气量比对照增加7.4%。以1%的投加量,在分别在试验初始和第3rd,6th,9th投加产氢菌,不同时间投加均能提高沼气总产量,其累积总产气量从大到小为3rd>6th>初始>9th,其中最适投加时间是3rd天,其累积产气量比对照增加14.4%。通过以上结果可知,添加产氢菌可以提高猪粪厌氧发酵的沼气产量,并具有一定的经济可行性和实际效益。

不同气相条件对单株产氢菌降解煤制氢的影响

为探究不同气相条件对产氢效应的影响,从煤中成功分离出一株高效产氢菌,采用液体培养基进行富集培养,经16SrDNA序列比对分析发现该菌株与肠杆菌属的Enterobacter cloacae同源性最高。讨论了不同碳源对产气效果的影响,优选出葡萄糖作为该菌最适宜的营养物质。利用葡萄糖作为培养基中的碳源进行富集,以煤为底物进行产氢发酵实验,分别通入氦气、二氧化碳、一氧化碳和空气,测定菌液浓度,讨论不同气氛条件下对产气效果的影响。结果表明:通入氦气菌液浓度明显提高,产氢效果最好,产氢效率达到1.87 mL/h;通入一氧化碳产氢效果最差,通入空气对产氢有明显的抑制作用,通入二氧化碳能促进产氢但效果不如氦气;对反应末端的固体分析后发现不同气相条件下煤的密度变化不大;通入氦气的煤样兰氏体积增大约10%,证明氦气条件下Enterobacter cloacae对煤的利用更彻底。

产氢菌对沼气发酵的生物强化作用

在以猪粪为底物的沼气发酵系统中,投加产氢菌Clostridium sp.WY-1与Clostridium sp.WW-5混合后离心的菌体,加入量以两株菌的混合菌液计,分别为发酵液总体积的2%、4%、8%、16%,30℃下发酵30 d,研究产氢菌投加对产甲烷系统的生物强化效应.结果表明,2%、4%、8%、16%四种不同投加量均能提高甲烷总产量,累积甲烷产量比对照分别增加6%、11%、4%、3%,其中投加量4%增加最高;而对甲烷浓度无明显提高.在发酵前3 d,各组中均能检测到少量的氢气,投加产氢菌各组中d 2的氢气含量均比对照高,d 3对照组、2%和4%组检测不出氢气,但8%、16%组仍有极少量氢气存在.总挥发性有机酸在发酵过程中总体趋势是不断下降,发酵前20 d投加产氢菌组的总挥发性有机酸含量均比对照组高.投加产氢菌各组中产氢菌和产甲烷菌的数量与对照组相比均有所增加,而投加量4%组中产氢菌和产甲烷菌的数量比投加2%、8%和16%中的产氢菌和产甲烷菌的数量高.

利用产氢强化微生物降解原油产甲烷实验

在微生物降解原油产甲烷过程中,如何有效地提高微生物产甲烷能力是目前研究的技术难点之一。为了能够在短时间内利用微生物产生更多的甲烷气,提高产甲烷效率,利用污水处理厂活性污泥具有产氢和产甲烷的特性,筛选出具有稳定产氢能力的产氢菌,其菌液每100 mL产氢量可达到0.8 mmol左右;再利用产氢菌培养后产H2和CO_(2)以及发酵液中挥发性脂肪酸积累的特性,为产甲烷菌提供相对充足的代谢营养底物来提高产甲烷效率;通过产氢、产甲烷两阶段培养的方式,在20 d内产甲烷能力即可得到显著提升,所产气体中甲烷体积分数可达79%以上,与传统非结合方式产甲烷气体系相比,产甲烷速率提高了10倍,达到0.0875 mmol/d,证明了应用该方法提高产甲烷效率的有效性。研究成果为进一步提高微生物降解原油产甲烷的转化效率提供了技术方向,同时也为CO_(2)注入产甲烷等技术的研究提供了借鉴。

产氢发酵细菌培养基的选择和改进

高效产氢菌株的筛选与分离是生物制氢技术应用的重要基础之一 ,现有培养基都存在一定缺陷 .为分离到高效产氢菌株 ,提出LM系列培养基配方 ,并通过产氢发酵细菌的分离和生长实验 ,确定了培养基的强还原剂为半胱氨酸 ,pH值为 6 .根据培养基对厌氧菌的分离数量、种类和培养基成分的分析 ,选择LM - 1培养基为产氢发酵细菌的分离培养基 .LM - 1培养基分离出的 5株高效产氢发酵细菌属于 4个菌属 ,其中拟杆菌属、克雷伯氏菌属是国际上尚未分离到的高效产氢发酵细菌 .利用LM - 1培养基进行高效产氢细菌分离操作 。

用CODEHOP设计简并引物克隆B49乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACK-J1以高效产氢菌B49基因组DNA进行PCR,得到655bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,发现此DNA产物与其他乙酸激酶基因有高度的相似性.所克隆的序列为B49的乙酸激酶基因片段.用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高.该基因的成功克隆将为高效产氢菌B49代谢工程研究和降低其反应器酸化研究提供科学依据.