高产淀粉酶枯草芽胞杆菌的诱变选育和酶学性质研究

为了提高产淀粉酶枯草芽胞杆菌BacillussubtilisN21的酶活，试验采用紫外线对该菌株进行诱变，并对该淀粉酶的部分酶学性质进行了研究。结果表明，淀粉酶酶活由出发株的32．96U／mL增加到86．24U／mL．比原菌株酶活提高了161．65％。该酶的最适反应温度为35℃，最适pH值为7．0，在30—40℃，pH值为5．0～8．0条件下较稳定。Ca2＋和Mn2＋对酶有激活作用，Cu2＋、Zn2＋对酶有抑制作用，而Mg2＋、Fe2＋对其影响较小。说明筛选出1株产酶活性较强的突变菌株。

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子Pglv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数Km为(1.26±0.17)g/L、kcat/Km为(2275.07±32.83)L/s·g,纯酶在4℃储存14 d后保留40%的酶活力。本研究成功构建出安全、高效表达重组麦芽四糖淀粉酶的表达系统,为其规模化制备和应用提供了新策略。

枯草芽胞杆菌α-淀粉酶高产菌株的选育

以Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１４１４０为出发菌株，经亚硝基胍反复多次处理和筛选，该菌α－淀粉酶酶活从８０００Ｕ／ｍｌ提高到３４２００Ｕ／ｍｌ，并探讨了一种高效的α－淀粉酶选育方法．另外在摇瓶培养过程中，探讨了培养基碳源、氮源对该菌株产酶特性的影响．

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其产脂肪酶特性

【目的】对1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定并对其产脂肪酶特性进行研究,为后期规模化发酵生产脂肪酶及其在畜牧业中的实际应用奠定基础。【方法】采用形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA测序分析,对实验室分离保存的1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定;通过菌落和芽胞计数、生长曲线测定,对MY016的生长特性进行分析;通过产脂肪酶量和酶活检测、脂肪酶基因扩增和系统进化分析,对MY016菌株的产脂肪酶特性进行探讨。【结果】产脂肪酶细菌MY016经形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分析,被鉴定为枯草芽胞杆菌。MY016在培养2 h后进入对数生长期,生长迅速;培养10 h其菌液600 nm吸光度最高达到4.7,随后进入稳定期;12 h时活菌数约为5.3×10^(9)CFU/mL;培养22 h后开始二次生长,吸光度最高达5.2;培养46 h后进入衰退期。芽胞观察和计数结果显示,MY016菌株在接种16 h后开始形成芽胞,随着培养时间延长,芽胞形成率逐渐升高,直至72 h完全形成芽胞,芽胞数最高为1.9×10^(9)CFU/mL。产脂肪酶能力检测结果显示,MY016菌株在培养36 h时产酶量达到最大,为246.918 mg/L,然后总酶量逐步降低;48 h时总酶活达到最高,约为281.883 U/L。成功扩增了MY016菌株的脂肪酶基因,并构建系统进化树,结果显示MY016脂肪酶基因与其他芽胞杆菌的脂肪酶基因亲缘关系最近,表明其脂肪酶基因进化保守。【结论】产脂肪酶枯草芽胞杆菌MY016生长迅速、产酶量稳定,总酶活较高,适合后期规模化生产和在畜牧业中推广应用。

一株产α-淀粉酶的枯草芽胞杆菌分解淀粉的能力

目的探讨一株产α-淀粉酶菌株(B.subtilisHY-02)分解淀粉的能力。方法将枯草芽胞杆菌(HY-02)分别接种于0.5%,1.0%,1.75%淀粉溶液,连续培养240h,检测α-淀粉酶活力、细菌计数及淀粉浓度。结果1.75%淀粉组诱导菌株产α-淀粉酶、细菌数及发酵生物量干重均较0.5%、1%淀粉组明显增加。结论枯草芽胞杆菌(B.subtilisHY-02)与出发菌株相比有较强的分解淀粉能力。

温度对枯草芽胞杆菌α-淀粉酶活性的影响

目的 :探讨温度对枯草芽胞杆菌分解淀粉的影响 ,找出α-淀粉酶活性区间。方法 :设淀粉实验组及无淀粉对照组。接种枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌 4组 16管 ,空白对照、实验管 4组 8管 ,15℃、2 5℃、37℃、4 0℃温箱连续培养 ,测量不同时间段内pH值及酶活值 ,观察颜色的变化。结果 :在 15℃～ 4 0℃下温度越高接种管颜色、pH值、透光度变化越明显。结论 :温度对枯草芽胞杆菌α -淀粉酶活性影响较大 ,尤其在 2 5℃～ 4 0℃区间内分解淀粉能力很强 ,这为选择微生物法解决淀粉导致的水源富营养化提供了依据 ,也是可行的。

枯草芽胞杆菌NRCB002发酵液的促生效应及高产乙偶姻发酵条件优化

[目的]本文旨在明确枯草芽胞杆菌发酵液组分对番茄幼苗生长的影响,针对有效代谢产物进行发酵条件优化,为制备高效微生物肥料提供技术支持。[方法]以枯草芽胞杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)NRCB002为供试菌株,通过温室盆栽试验,明确NRCB002发酵液组分对番茄幼苗生长和根系形态的影响;以NRCB002菌株生长量及代谢产物乙偶姻产量为评价指标,通过单因素优化法确定碳源和氮源的种类、浓度、发酵温度和发酵时间,通过正交试验设计和极差分析优化无机盐成分。[结果]与去离子水和发酵培养基对照相比,重悬菌液、发酵菌液上清、发酵菌液及含乙偶姻的重悬菌液均显著提高番茄株高、茎粗、叶面积、根冠比、总根长、总根表面积、总根体积、侧根数、地上部和根部的干重;其中,发酵菌液上清及含乙偶姻的重悬菌液处理的番茄幼苗地上部干重显著高于重悬菌液的幼苗地上部干重;发酵菌液上清、发酵菌液及含乙偶姻的重悬菌液处理的番茄幼苗根部干重显著高于重悬菌液处理的幼苗根部干重。以80 g·L^(-1)蔗糖为碳源、以25 g·L^(-1)酵母浸粉为氮源时菌株NRCB002的生物量和乙偶姻浓度均较高;最优无机盐组合:KH_(2)PO_(4)1.5 g·L^(-1)、MgSO_(4)·7H 2O 1.0 g·L^(-1)和MnSO_(4)·H_(2)O 0.2 g·L^(-1);优选的发酵温度为37℃,发酵时间96 h。使用优化后的发酵条件,用1 L摇瓶进行发酵,NRCB002生物量(D 600)为15.70,乙偶姻浓度为29.65 g·L^(-1),分别是初始发酵培养基的3.4和11.8倍。[结论]菌株NRCB002发酵液对番茄生长具有良好的促生作用,乙偶姻是其发酵液中关键的促生物质。

枯草芽胞杆菌GXHZ16抑制烟草疫霉病菌的表达谱分析

烟草黑胫病由烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae侵染引起,是烟草生产上一种分布广泛、为害严重的土传病害。本实验室前期从广西贺州富川烟区健康烟株根际土壤中分离筛选获得一株枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis GXHZ16,对峙培养发现该菌株对烟草疫霉菌具有良好的拮抗活性(抑制率65.79%)。为探究菌株GXHZ16对烟草疫霉菌的可能抑制分子机理,本研究分别针对枯草芽胞杆菌GXHZ16与烟草疫霉菌对峙培养36h(处理组)和0h(对照组)的混合样品,采用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术结合生物信息学分析对峙培养36 h后枯草芽胞杆菌的基因差异表达谱及所涉及的信号通路变化。结果发现:对峙培养36 h后枯草芽胞杆菌GXHZ16有1607个基因发生了显著差异表达,包括810个上调表达基因和797个下调表达基因;其中筛选获得的显著表达基因特别是上调表达的基因(包括鞭毛装配、细菌趋化性相关基因以及与表面活性素、丰原素和制磷脂菌素合成相关的10个相关基因)可能均涉及枯草芽胞杆菌对烟草疫霉菌的抑制作用。进一步的GO富集分析显示,共有1343个差异表达基因被注释到不同的功能亚类中,涉及差异基因最多的为细胞组分类别中的细胞解剖实体。特别地,KEGG富集分析显示,共有551个差异表达基因归到数百个Pathway中,其中涉及差异表达基因最多的是微生物在不同环境中的代谢途径;其他主要代谢途径有鞭毛装配和淀粉蔗糖代谢等;此外,细菌趋化性通路和单环菌素生物合成通路也高度富集。总之,本研究从转录组水平分析获得了枯草芽胞杆菌(与烟草疫霉对峙培养后)的基因差异表达图谱及相关调控代谢途径;为进一步阐明芽胞杆菌抑制植物病原真菌的生防机制并提高枯草芽胞杆菌的生防效果奠定了基础。

产蛋白酶枯草芽胞杆菌益生菌种的筛选与应用

本研究从健康鸡体内分离、选育出一株可产中性蛋白酶的枯草芽胞杆菌 ;将其作为益生素生产菌种 ,制备了微生态制剂———益生素 ;并对该菌的生物学性状、产酶性状和饲喂效果进行了系统研究。研究表明该枯草芽胞杆菌培养48小时 ,培养液中含蛋白酶活力可达 1 0 32 .56U ml;Bulb C小鼠腹腔注射和海兰白蛋公雏鸡口服试验均表明 ,该菌对动物安全 ;连续传代及体外保存一年生物性状稳定。饲喂实验表明 ,该益生素能明显促进肉用仔鸡的生长发育 ,到实验期末 ,提高肉用仔鸡体重 7.32 % ,肉用仔鸡的累积饲料转化率提高 8.96 %。对肉用仔鸡 ,合适的添加剂量为 0 .1 %(W W) (含H1菌 7.1 0× 1 0 5CFU g饲料 )

枯草芽胞杆菌降解木质纤维素能力及产酶研究

从农林废物堆肥中分离得到1株细菌经鉴定为枯草芽胞杆菌,将该细菌用于木质素类化合物利用,固态培养条件下考察其对木质纤维素的降解能力及产酶特性,另外对发酵前后的稻草结构进行了红外光谱分析。结果表明,枯草芽胞杆菌具有木质素降解能力,兼具低分子量木质素酚型、非酚型类物质的降解能力。其对木质素降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果。在实验条件下,培养30 d使木质素降解率达9.47%,同时对纤维素、半纤维素也有较高程度的降解;降解率分别为38.8%、41.84%。红外光谱分析结果表明,稻草木质素结构被破坏,枯草芽胞杆菌对木质素各官能团的降解作用有所不同。

枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺优化

[目的]枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)T-500是1株对水稻纹枯病和稻瘟病均有良好防治效果的生防菌,通过优化其摇瓶发酵工艺,从而提高发酵液中脂肽类抗生素的含量,为T-500菌株生防制剂的开发提供技术支撑。[方法]以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)为指示菌,利用酸沉淀法提取T-500菌株发酵液中的脂肽类抗生素,并进行脂肽抗生素粗提液的抑菌效果分析,筛选影响抑菌效果的发酵培养基主成分;随后通过Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计和响应曲面法,优化T-500菌株高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分和发酵条件。[结果]T-500菌株高产脂肽类抗生素的最佳培养基为:黄豆饼粉7.00 g·L^(-1),蛋白胨4.92 g·L^(-1),酵母粉1.90 g·L^(-1),小麦粉5.00 g·L^(-1),玉米糊5.00 g·L^(-1),NaCl 1.00 g·L^(-1),MgSO_40.20 g·L^(-1),MnSO_45.0 mg·L^(-1),FeSO_40.5 mg·L^(-1)。最佳发酵培养条件为:装液量500 mL三角瓶装105 mL,接种量0.87%,发酵时间41.35 h,温度28℃,转速180 r·min^(-1)。利用最佳摇瓶发酵工艺,T-500菌株所产生的脂肽类抗生素对纹枯病菌的抑菌带最宽,达(11.23±0.15)mm,菌含量达(7.41±1.18)×109CFU·mL^(-1)。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证,理论预测值与实际值无显著差异。质谱和色谱检测表明:优化发酵工艺后产生的Surfactin含量较基础培养基提高了48.2%,Iturin含量较基础培养基提高了180.9%;优化发酵工艺后检测到了Fengycin的产生,但优化前未发现Fengycin的产生。[结论]利用响应曲面法成功优化了枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺;优化后,T-500产脂肽类抗生素产量增加,抑菌活性增强。

枯草芽胞杆菌B006产表面活性素的培养条件优化

芽胞杆菌产生的环脂肽类生物表面活性素surfactin具有重要抗菌、促进生物膜形成等功能,其含量和同系物组分构成影响其功能。为了提高芽胞杆菌B006产生表面活性素的产量,通过单因素实验和正交实验,测定了碳源、氮源和无机盐等营养物质及接种量、培养时间、装液量和初始pH值对芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的影响;采用排油圈法测定发酵液中表面活性素的产量,采用HPLC-MS方法比较培养基优化前后surfactin的产量和组分含量。结果表明,适合芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的培养基组成为:牛肉膏10 g/L、玉米粉15 g/L、硝酸铵3 g/L和氯化钠3 g/L;适合的培养条件为:初始pH值7.0、接种量10%、装液量60 m L/500 m L,发酵周期64 h。优化后surfactin的产量约为314.73 mg/L,比优化前提高了74.88%;surfactin各组分比例发生改变,其中C16和C17组分的含量明显提高,为优化前相应组分含量的1.64和8.34倍。优化的培养基组分和培养条件可明显提高芽胞杆菌B006菌株产生surfactin的产量,改变surfactin同系物组分的构成,为利用芽胞杆菌B006进行高活性表面活性素的工业生产和代谢调控研究奠定了基础。

枯草芽胞杆菌B201产芽孢培养基优化

采用单因素试验及正交试验设计对枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis B201产孢培养基进行了碳源、氮源、无机盐筛选及优化,最终确定B201发酵培养基配方为玉米粉3 g/L,糖蜜10 g/L,豆粕粉10 g/L,鱼粉10 g/L,K_2HPO_4 2 g/L,Na_2HPO_4 2 g/L,MgSO_4 0.5 g/L,MnSO_4 0.5 g/L。优化后的培养基在500 L通气式机械搅拌发酵罐中进行了小试,结果表明B201生长快速,发酵16 h开始形成芽孢,26 h放罐后发酵液活菌量达到1.06×10^(10) CFU/m L,芽孢量8.8×10~9 CFU/m L,芽孢形成率为83.0%,活菌含量和芽孢形成率较高,为B201工业化生产奠定了基础。

不同碳氮源对枯草芽胞杆菌BAB−1产抗菌脂肽的影响

枯草芽胞杆菌BAB−1是一株对设施蔬菜气传病害具有较好防治效果的生防菌,前期研究表明脂肽类抗生素是其产生的主要抑菌物质之一。为提高菌株BAB−1脂肽类抗菌物质的产量,本研究通过快速蛋白液相层析(Fast protein liquid chromatography,FPLC)分析了5种碳源及5种氮源对菌株BAB−1脂肽类抗菌物质产量的影响,进一步采用溶血圈试验及排油圈法测定粗脂肽的性质。结果表明,熊果苷是BAB−1菌株产生surfactin的最佳碳源,其surfactin产量分别是葡萄糖、D−木糖、D−核糖及L−阿拉伯糖的2.95、7.01、4.26及5.60倍,此时菌株BAB−1粗脂肽的溶血活性与排油能力最强;熊果苷与葡萄糖利于该菌株产生fengycin,二者的fengycin产量没有显著差异,但显著高于D−木糖、D−核糖及L−阿拉伯糖。L−天冬酰胺与L−谷氨酸钠是菌株BAB−1产生抗菌脂肽的良好氮源,二者的surfactin与fengycin产量没有显著差异,但显著高于L−半胱氨酸、L−脯氨酸及L−谷氨酰胺,以这2种物质为氮源时菌株BAB−1粗脂肽的溶血活性与排油能力均较强。通过RT−qPCR技术分析了不同碳源对surfactin合成酶基因srfAA表达的影响结果表明,以熊果苷为碳源时,菌株BAB−1中srfAA基因的表达量相比葡萄糖提高了2.9倍。上述结果为菌株BAB−1产抗菌脂肽类物质发酵工艺的优化及其工业化生产提供了一定的理论支持。

不同培养条件对枯草芽胞杆菌BS168-ΔsinR生物膜形成及维生素K2产量的影响

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是合成维生素K2的微生物之一,维生素K2的合成量又与细菌生物膜有重要关系。其中sinR是生物膜形成环节中的关键调节基因,我们用同源重组的方法构建枯草芽胞杆菌sinR缺失突变体(ΔsinR)菌株,再以BS168-ΔsinR菌株为出发菌株,采用微孔板法-结晶紫染色测定生物膜形成量,核酸定量仪测定胞外蛋白,苯酚硫酸法测定胞外多糖,HPLC测定维生素K2的生物合成量。比较分析了不同温度、pH、以及不同浓度的金属离子(Mn^(2+)、 Fe^(2+)、Ca^(2+))对枯草芽胞杆菌BS168及BS168-ΔsinR生物膜形成能力以及维生素K2合成量的影响。结果表明,重组菌BS168-ΔsinR生物膜形成能力和维生素K2合成能力均优于原始菌BS168,且重组菌在生物膜形成、维生素K2合成过程中对温度、酸碱性的适应能力也强于原始菌。一定浓度的金属离子可以促进生物膜的形成及维生素K2的合成。2株菌生物膜形成的最佳条件为温度37~40℃、pH 8.0、Mn^(2+)浓度0.01 mmol/L、 Fe^(2+)浓度1μmol/L、Ca^(2+)浓度0.01 mmol/L,维生素K2合成的最佳条件是温度40℃、pH 7.0~8.0、Mn^(2+)浓度0.1 mmol/L、 Fe^(2+)浓度50μmol/L、Ca^(2+)浓度1 mmol/L。该研究为深入探究sinR基因参与枯草芽胞杆菌生物膜形成的机制及提高维生素K2合成产量提供实验基础和理论支撑。

内生枯草芽胞杆菌WZ10对马铃薯枯萎病防效及功能测定

为明确枯草芽胞杆菌WZ10的生物学功能及对马铃薯枯萎病的室内防治效果。本研究利用Salkowski’s比色法和分光光度法、室内盆栽试验对菌株WZ10促生能力进行测定;通过室内防病试验和生理生化测定分析菌株WZ10的防病效果;并利用透明圈法对其解磷、解钾能力进行测定。结果表明,枯草芽胞杆菌WZ10具有产IAA和解无机磷能力,并对马铃薯植株的生长有明显的促生作用,与对照植株相比,接种菌株WZ10后马铃薯植株的株高、根长和鲜重均显著增加,分别提高了14.34%、19.75%和77.07%,马铃薯植株的PPO、POD、SOD酶活性和可溶性蛋白含量显著升高。同时,菌株WZ10对马铃薯枯萎病的室内防治效果达80.65%,显著高于30%甲霜·噁霉灵水剂处理。菌株WZ10具有较强的促生能力,且对马铃薯枯萎病具有显著的防治效果,该研究可为后续菌株WZ10功能开发和枯萎病病害防治奠定基础。

枯草芽胞杆菌ZWZ-19可分散油悬浮剂的研制及对马铃薯腐烂茎线虫病的防治效果

为开发马铃薯腐烂茎线虫病的防治药剂,本研究利用前期获得的枯草芽胞杆菌ZWZ-19,制备一种可用于马铃薯拌种的可分散油悬浮剂。通过测定不同乳化剂对制剂稳定性的影响,结合制剂的悬浮率、倾倒性、粒径、静态表面张力及动态接触角等指标,筛选出ZWZ-19可分散油悬浮剂的最佳配方为:20%枯草芽胞杆菌母药、15%NP-10、3%有机土、0.5%乙二醇、3%白炭黑,大豆油补足至100%。该制剂热储前后悬浮率均高于95%,且有效成分分解率低于5%。田间试验结果表明,ZWZ-19可分散油悬浮剂对马铃薯腐烂茎线虫病的防效为69.61%,增产效果达到16.38%。

枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物对黄曲霉菌生长以及产毒效果的影响

旨在探讨枯草芽胞杆菌、乳酸菌混合培养物对黄曲霉菌生长及产毒影响。将枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌菌种复苏后培养,调整浓度为1×108cfu/mL,将枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌按照1∶1比例制成混合培养物。在黄曲霉菌培养过程中分别加入枯草芽胞杆菌、乳酸杆菌和混合培养物3种不同类型益生菌,分别测定3种不同类型益生菌对黄曲霉菌菌落生长抑制率、黄曲霉菌孢子生长抑制率和黄曲霉产毒量抑制效果。结果显示,在培养72h、96h时,混合培养物处理组黄对曲霉菌菌落生长抑制率均高于枯草芽胞杆菌处理组和乳酸杆菌处理,差异显著(P<0.05);在培养6h、18h、24h时,混合培养物处理组对黄曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞杆菌处理组和乳酸菌处理组,差异显著(P<0.05);培养18h、24h时,混合培养物处理组对黄曲霉菌产毒量抑制率与枯草芽胞杆菌处理组、乳酸菌处理组相比较,差异显著(P<0.05)。综上所述,枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌混合培养物对黄曲霉菌生长及产毒具有明显抑制效果。

一株枯草芽胞杆菌分解淀粉能力的研究

目的 :研究一株枯草芽胞杆菌分解淀粉的能力及其α 淀粉酶活性。方法 :实验设无淀粉对照组及不同淀粉浓度实验组。接种枯草芽胞杆菌 ,37℃恒温摇床 ,2 0 0r/min ,连续培养 ,不同时间段内测酶活值、细菌计数及淀粉消耗量。结果 :淀粉浓度在 1 75 %时淀粉消耗量、α 淀粉酶活性、细菌数及发酵生物量干重均较 0 5 %、1 0 %实验组明显增加。结论 :37℃温度下 ,枯草芽胞杆菌分解淀粉的能力很强。

枯草芽胞杆菌在动物生产中的应用

主要介绍了枯草芽胞杆菌对动物的生长性能、免疫指标和抗病力的影响,以及对养殖水体的净化作用,以期为在畜牧生产实践中合理利用枯草芽胞杆菌提供一定的理论依据。