富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施,疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述,并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战,提出了高效疫苗的研究策略,旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。

产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制

目的利用PCR和基因定点突变技术,分别扩增出K88ac、K99、LTB和突变的ST1基因,构建了重组菌株BL21(DE3)(pXKKSL4),酶切鉴定和序列分析表明构建的pXKKSL4表达载体包含有K88ac-K99-3ST1-LTB融合基因且阅读框架正确。方法SDS-PAGE分析表明融合蛋白占菌体总蛋白含量的35.72%。ELISA检测证实融合蛋白能与ST1单抗、LTB、K88ac和K99抗体相结合。结果乳鼠灌胃实验表明K88ac-K99-3ST1-LTB融合蛋白已失去ST1天然毒性,免疫保护试验表明菌株氢氧化铝佐剂苗和包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗均具有良好的免疫效果,其免疫保护率分为98%和96%。结论上述研究表明构建的四价灭活疫苗不但解决了ST1肠毒素毒性问题,而且又赋予其免疫原性,同时增加K99菌毛可使免疫效果进一步增强,这样从肠毒素和菌毛两种途径,达到预防由ETEC引起的腹泻目的,从而有效控制腹泻的发生,为将来制备产肠毒素大肠杆菌基因工程灭活疫苗打下坚实基础。

抗仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻(piglet diarrhea)是国内外养猪业面临的一大难题,每年因此造成的经济损失十分巨大。导致仔猪腹泻的主要致病菌是产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC),其致病过程依赖黏附素和肠毒素的共同作用。随着研究手段的创新,国内外学者在研制ETEC疫苗方面已取得了突破性进展。作者介绍了ETEC的致病特点,并对各类ETEC疫苗的研究进展作一综述。

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.

产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究概况

产肠毒素性大肠杆菌(简称ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中,尤以初生幼畜特别易感,并引起生长发育迟缓,生产能力低下,甚至造成死亡,给畜牧业造成很大损失。ETEC肠毒素基因和菌毛蛋白(黏附素)基因对于ETEC的致病性起主要作用。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗为疫苗的研制提供了新的思路。本文概述并评价了各类产肠毒素性大肠杆菌疫苗,并简要介绍了产肠毒素性大肠杆菌疫苗最新的进展。

猪源产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻是全球集约化猪场的高发疾病之一,给养猪业造成了巨大的经济损失。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是导致新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要致病菌,菌毛黏附素和肠毒素是其重要的致病因子。接种疫苗是仔猪腹泻最有效的防治方法,然而ETEC疫苗有明显的地域局限性和安全性问题。因此,研制安全、高效且适用性广的ETEC疫苗对畜禽养殖业具有重要意义。近年来在ETEC疫苗的研制方面已取得了重大进展,出现多种亚单位疫苗、基因工程疫苗和弱毒疫苗。本文对ETEC的致病机制及相关疫苗的研究进行简要介绍。

产肠毒素型脆弱拟杆菌促进结直肠癌发生发展的机制研究进展

脆弱拟杆菌是人体肠道常见的革兰阴性专性厌氧菌。根据能否合成分泌脆弱拟杆菌肠毒素,其可分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌。ETBF是结直肠相关性疾病中检出率最高的厌氧菌,但由于分离、培养和检测均相对困难,有关ETBF的研究仍较少。随着宏基因组学的兴起,肠道菌群成为研究热点,ETBF的生物学特性和功能得到进一步阐明,其可能对结直肠癌(CRC)的发生发展有积极促进作用,如诱导慢性炎症的发生,激活Wnt/β联蛋白通路促进结直肠细胞的增殖等。因此,探讨ETBF的生物学功能及其在CRC中的作用机制对CRC的筛查和预防尤为重要,未来应对ETBF在CRC病变早期的丰度变化、功能作用以及具体调控机制进行深入研究。

国内外猪源产肠毒素大肠杆菌疫苗研究进展

仔猪腹泻是全球规模化猪场最常见的疾病之一,给养猪业带来了巨大的损失。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原菌,黏附素和肠毒素是其重要的致病因子,ETEC通过黏附素定植于小肠上皮细胞,在增殖过程中不断产生肠毒素,引起大量水和电解质进入肠腔,导致仔猪腹泻。目前,疫苗免疫是预防ETEC最有效的方法,然而许多商品化大肠杆菌疫苗的临床免疫效果不佳,且地域局限性明显。因此,研制安全、高效、广谱的ETEC疫苗对养猪业具有重要意义。近年来,许多新型试验性ETEC疫苗被相继报道,如ETEC菌毛黏附素和肠毒素疫苗;一些新开发的疫苗,如亚单位疫苗、菌影疫苗、植物载体疫苗和囊泡疫苗等,具有不同的优势,在不同的动物试验中均表现出良好的免疫保护效果。文章简述了国内外学者在ETEC疫苗领域的研究进展,对猪源ETEC各类疫苗的优劣及应用研究情况进行了综述,以期为今后猪源ETEC疫苗的研究提供参考。

植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制。试验利用植物乳杆菌预处理猪肠上皮细胞IPEC⁃J23 h,ETEC刺激细胞1、3、6、12和24 h,收集细胞及其培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素-1β(IL⁃1β)、白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)的含量,采用实时荧光定量PCR检测细胞中Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)以及NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体6(NLRP6)的表达,采用Western blot检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38和细胞外信号调节激酶(ERK)]和核转录因子-κB(NF⁃κB)p65的磷酸化水平以及紧密连接蛋白———闭合小环蛋白-1(zonula occludens⁃1,ZO⁃1)和闭锁蛋白(occludin)的表达。分别采用p38 MAPK抑制剂、ERK⁃MAPK抑制剂和NF⁃κB p65抑制剂处理IPEC⁃J2细胞1 h,再用植物乳杆菌预处理细胞3 h,最后用ETEC处理细胞24 h,收集细胞和培养上清,采用ELISA法检测IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果表明:1)与ETEC处理相比,植物乳杆菌预处理能够极显著降低ETEC感染12~24 h细胞产生IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α的含量(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染3~12 h细胞中TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6的mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01),极显著降低ETEC感染24 h细胞中TLR2和NLRP3的mRNA相对表达量(P<0.01),极显著降低ETEC感染3~6 h细胞中p38 MAPK和NF⁃κB p65的磷酸化水平(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染6~24 h细胞中ZO⁃1和occludin的表达量(P<0.05或P<0.01)。2)与ETEC处理相比,抑制剂和植物乳杆菌共同作用能够极显著降低ETEC感染细胞产生IL⁃1β、IL⁃8、TNF⁃α的含量和LDH的活性(P<0.01),植物乳杆菌单独作用也可以极显著降低ETEC感染细胞产生LDH的活性(P<0.01),并且信号通路抑制剂对植物乳杆菌调控部分促炎性细胞因子的产生有协同作用。综上所述,植物乳杆菌可以通过致弱p38 MAPK磷酸化和阻断NF⁃κB信号通路的活化而降低炎症相关因子的产生,从而表现出提高猪肠上皮细胞完整性的潜力。

产肠毒素大肠杆菌病商用疫苗的研究进展

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是产房仔猪腹泻的主要细菌性病原,可引起仔猪的黄痢、白痢,给各国养猪业造成较大的经济损失。这也使得很多学者对于如何预防或治疗仔猪黄痢有较深的研究,在我国饲料禁抗的政策下,通过疫苗来预防ETEC引起的黄痢显得尤为重要。文章将展示现阶段,国内外关于该类商用疫苗的研究进展。

貉产肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

致病性大肠杆菌能产生一种或多种肠毒素,称为毒素型大肠杆菌(ETEC)。ETEC是导致人畜腹泻的主要致病菌,借助于所产生的菌毛抗原黏附于动物小肠粘膜定居并产生作用于肠壁的外毒素称为肠毒素。主要有两类肠毒素:一类是不耐热性肠毒素,即热敏感性肠毒素(LT);另一类是耐热性肠毒素,即热稳定性肠毒素(ST)。仔猪的黄、白痢。

仔猪肠产毒素型大肠杆菌的分离与鉴定

从腹泻死亡仔猪分离出一株大肠埃希氏杆菌，经家兔回肠结扎试验证明能产生热敏肠毒素（ＬＴ）；药敏试验表明对ＳＭＺ＋ＴＭＰ、链霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，对四环素、氨苄青霉素不敏感；用分离菌株制成灭活油剂苗对８０头怀孕母猪进行免疫接种结果所生小猪在４０ｄ获得１００％保护率。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LT、ST融合的研究进展

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)肠毒素LT与ST融合是ETEC多价疫苗候选株研制的一项重要工作,LT与ST的化学偶联研究已证明融合后可使小分子的ST获得免疫原性成为完全抗原,而基因融合对构建多价疫苗则是更重要的手段。本文着重介绍了近年来对LT与ST基因融合的研究,特别是一些影响基因融合效果因素的基础性研究。这些都为候选株的研制提供了研究手段和依据,并对广泛的基因融合研究具有理论意义。

广州市腹泻病人香港海鸥形菌和产肠毒素性大肠杆菌感染情况调查及耐药性检测

目的初步了解广州市腹泻病人中香港海鸥型菌(LH)和产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)感染情况和分离株的耐药情况。方法2008年9月～2009年10月于广州某医院采集了646例门急诊腹泻患者的新鲜粪便标本,用EC肉汤进行增菌,并分别采用麦康凯平板及头孢哌酮麦康凯平板进行ETEC和LH的分离培养;用生物梅里埃API20NE和API20E进行生化鉴定;用PCR方法进行基因鉴定;K-B纸片扩散法作耐药性检测。结果646例标本中未检出LH,检出38例ETEC,检出率6%。药敏结果显示ETEC对头孢类抗生素的敏感性较高,而对青霉素类,四环素类及磺胺类抗生素耐药率较高。结论广州市LH的人群感染率可能较低;ETEC引起的腹泻较10年前有降低倾向,仍需进一步做多中心调查。食用水产品可能是ETEC感染的主要危险因素之一;治疗ETEC类腹泻建议首选头孢类抗生素。

产肠毒素性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌的毒力因子主要有黏附素、毒素、EatA等。在大肠杆菌侵袭宿主组织并引起其发病的过程中,这些毒力因子相互协调、发挥作用。文章对毒力因子的致病作用、致病机理、免疫原性及其在疾病防制中的应用几个方面的研究概况作了综述,为防制大肠杆菌病、研制新型高效的大肠杆菌疫苗提供了理论依据。另外,文章还介绍了近年来已相继研制成功的全菌体疫苗、单价或多价基因工程菌毛疫苗以及重组肠毒素双价基因工程苗等。展现了新型疫苗的研制。

影响大肠杆菌不耐热肠毒素2型毒性的氨基酸初步筛选

为探究影响产肠毒素大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素2型(LT2)毒性的关键氨基酸及其突变重组蛋白的免疫原性,本研究扩增了LT2编码基因elt2,并采用重叠延伸PCR(SOE PCR)方法分别对其A亚基进行R5K、H42A、S59K、V95K、Y102K和E110K的单突变,将elt2及其6个突变基因分别双酶切后克隆于pET-30a中构建重组大肠杆菌pET-30a-elt2/BL21、pET-30a-R5K/BL21、pET-30a-H42A/BL21、pET-30a-S59K/BL21、pET-30a-V95K/BL21、pET-30a-Y102K/BL21、pET-30a-E110K/BL21,经IPTG诱导表达了重组LT2(rLT2)及其突变重组蛋白mrLT2-R5K、mrLT2-H42A、mrLT2-S59K、mrLT2-V95K、mrLT2-Y102K、mrLT2-E110K;利用细胞毒性试验和小鼠致病性试验比较了rLT2和突变重组蛋白对小鼠肾上腺皮质瘤(Y1)细胞的毒性作用及对小鼠的致病性,并将rLT2和mrLT2-V95K作为免疫原接种小鼠检测其对小鼠的免疫原性。结果显示,突变重组蛋白对Y1细胞的毒性作用均弱于rLT2,其中mrLT2-V95K对Y1细胞的毒性作用最弱为1.145×10^(1)TCID_(50)/0.1 mL;rLT2及该突变重组蛋白对小鼠均无致病性,表明小鼠也不适合用于LT2的致病性检测。mrLT2-V95K免疫BALB/c小鼠的血清特异性IgG抗体效价和对rLT2的中和抗体效价分别为1:102 400和1:32,与rLT2的免疫原性无显著差异。本研究首次证实LT2 A亚基的aa95对LT2细胞毒性作用的影响较明显,其突变重组蛋白具有良好的免疫原性,为大肠杆菌减毒疫苗研究提供了重要科学信息。

非产肠毒素型脆弱拟杆菌通过下调NF-κB通路抑制TNF-α诱导的结肠上皮细胞炎症反应

目的探讨非产肠毒素型脆弱拟杆菌(NTBF)抑制TNF-α诱导的人正常结肠上皮细胞hcoEPIC炎症反应的机制,为结肠炎的预防和治疗探索新的益生菌疗法。方法建立NTBF与hcoEPIC细胞共培养体系,分别检测NTBF的黏附和侵袭能力;NTBF与hcoEPIC细胞共培养4 h后加入TNF-α诱导细胞炎症,24 h后CCK-8试验和AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞存活率及凋亡情况;Western blot和RT-qPCR检测不同处理组中hcoEPIC细胞内NF-κB信号通路关键蛋白质的变化;ELISA法检测该通路下游细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10的表达;体内动物实验评估NTBF干预对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠的影响。结果NTBF能够黏附于hcoEPIC细胞,对细胞无毒害作用。与对照组相比,NTBF单独处理并不影响hcoEPIC细胞增殖(P>0.05),但显著降低由TNF-α诱导的细胞损伤和凋亡(P<0.05);与TNF-α单独处理组相比,NTBF+TNF-α组中磷酸化NF-κB p65和磷酸化IκBα蛋白表达水平与NF-κB和IκBαmRNA水平显著降低(P<0.05);细胞上清液中IL-1β和TNF-α减少,IL-10增加(P<0.05)。动物实验表明NTBF能有效缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠症状,主要表现为抑制结肠炎小鼠体重减轻、降低疾病活动指数评分、改善结肠缩短、减轻结肠病理损伤。结论NTBF可能通过下调NF-κB通路抑制TNF-α诱导的结肠上皮细胞炎症反应。