产肠毒素大肠埃希菌sfmH基因的原核表达及多克隆抗体的制备

以产肠毒素大肠埃希菌F4ac(F4ac^+ETEC)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Sfm菌毛操纵子顶端黏附素sfmH基因,然后将PCR产物插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建出阳性重组质粒pET-28a(+)-sfmH,再将其导入大肠埃希菌BL21中进行诱导表达。通过对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行探究,发现重组菌在0.8mmol·L^(-1)IPTG、25℃诱导7h时蛋白表达量最高,且重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为26ku。将重组蛋白在最优诱导条件下进行大量表达并纯化,利用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得SfmH多克隆抗体(简称多抗),通过ELISA和Western blot试验对多抗效价和特异性进行鉴定。这一研究构建并获得了高纯度的融合蛋白rSfmH,将其免疫小鼠后成功获得鼠源高免血清,为进一步探究Sfm菌毛的功能奠定了研究基础。

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coliC83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coliXL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达。Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

大肠埃希菌F4菌毛凝集性单抗制备及抗原表位差异

采用杂交瘤单克隆抗体制备技术,获得4株能稳定分泌产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)F4菌毛特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8EH2、8EH3、9E10、11D4。免疫印迹和凝集反应结果表明:这4株单抗均能与纯化的F4菌毛蛋白发生特异性反应,且与F4大肠埃希菌不同血清型变异株F4ab、F4ac和F4ad发生特异性肉眼可见的凝集反应;而与F18、F6(987P)、F5(K99)产肠毒素大肠埃希菌参考株、分离株以及肠炎沙门氏菌参考株50336、分离株等多种肠杆菌科细菌无任何交叉反应。对单抗亚类的特性检测结果显示,这4株单抗均属于IgG1抗体,且主要识别F4ac的抗原表位,其中,8EH2、8EH3、9E10也能够较好地识别F4ab的抗原表位。结果说明F4菌毛凝集性单克隆抗体为ETEC F4感染的快速特异诊断提供技术基础。